[发明专利]一种快速鉴定长期保存后粪便样本质量的方法

说明书

本发明涉及一种快速鉴定粪便样本中微生物保存状态的方法及其应用。所述方法为实时荧光定量PCR，通过检测样本中3种或3种以上参考指标，判断微生物保存状态；所述参考指标包括芽孢杆菌属、拟杆菌属、乳杆菌属、肠球菌属、志贺菌属、双歧杆菌属、卟啉单胞菌属、大肠杆菌、共生梭菌、具核梭杆菌、微小微单胞菌等。基于本发明研发的试剂盒，快速准确，操作简便。

技术领域

本发明属于生物领域，涉及一种快速鉴定粪便样本中微生物保存状态的方法及其应用。

背景技术

生物样本是一类需要长期保存的样本，在临床检验和生物技术领域，经常涉及血液、尿液、粪便等生物样本的采集、包装、运输和保存问题，在此过程中存在易污染、易损耗、易霉变和已被破坏等问题，最终导致检验失败，失去检验价值。此外，由于长时间的保存，可能导致样本中的微生物含量和结构发生改变，影响科学研究的准确性。

目前主要用于鉴定微生物组成或含量是否改变的方法主要是变性梯度凝胶电泳（DGGE）和测序两种方法。这两种方法耗时长、操作过程繁琐且成本较高。需要进一步改进。

发明内容

针对现有检测技术的不足，本发明提供了一种快速省时、操作简便、成本经济的鉴定长期保存后粪便样本质量的方法。通过实时荧光定量PCR的检测方法，检测粪便样本保存前后微生物结构变化，鉴定长期保存后粪便样本质量，判定粪便样本是否还可用于科学研究。

为实现上述目的，本研究采用以下技术方案：

第一方面，鉴定粪便样本长期保存后样本质量的指标为粪便样本中常见菌种的组成变化。

优选地，可作为参考指标的菌群包括：芽孢杆菌属、拟杆菌属、乳杆菌属、肠球菌属、志贺菌属、双歧杆菌属、卟啉单胞菌属、大肠杆菌、共生梭菌、具核梭杆菌、微小微单胞菌等。

优选地，所述芽孢杆菌属包含枯草芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌、多黏芽孢杆菌等。

优选地，所述拟杆菌属包含脆弱拟杆菌、粪拟杆菌、吉氏拟杆菌、多毛拟杆菌、普通拟杆菌、埃格拟杆菌、卵圆拟杆菌、多形拟杆菌和单形拟杆菌等。

优选地，所述乳杆菌属包含德氏乳杆菌保加利亚亚种、德氏乳杆菌乳酸亚种、瑞士乳杆菌、干酪乳杆菌、高加索酸奶乳杆菌。

优选地，所述肠球菌属包含粪肠球菌、屎肠球菌、鸟肠球菌、酪黄肠球菌、坚忍肠球菌、芒地肠球菌、恶臭肠球菌、希腊肠球菌、孤立肠球菌、棉子糖肠球菌、假鸟肠球菌等。

优选地，所述志贺菌属包含痢疾志贺菌、福氏志贺菌、鲍氏志贺菌、宋内志贺菌等。

优选地，所述双歧杆菌属包含青春双歧杆菌、角双歧杆菌、动物双歧杆菌、星状双歧杆菌、两歧双歧杆菌、牛双歧杆菌、短双歧杆菌、齿双歧杆菌、长双歧杆菌、假小链双歧杆菌、嗜热双歧杆菌和嗜酸热双歧杆菌等。

优选地，所述卟啉单胞菌属包含牙龈卟啉单胞菌、非解糖卟啉单胞菌等。

优选地，选择上述细菌中3种或3种以上细菌作为参考指标。

不同生物样本中所含细菌种类不同，需根据科学研究所需样本类型选取菌种或菌属作为参考指标。

第二方面，作为参考指标的细菌引物组设计。

微生物16S rRNA序列包含9个可变区和10个高度保守区，本发明中，发明人为保证引物特异性，选择在保守区内设计引物；另外相对于其他可变区，V3-V4区能够覆盖98%以上的细菌，且V3-V4区扩增产物长度符合qPCR对引物预期产物的长度要求；以此为条件，设计得到一对符合要求的总菌引物，可以对生物样本中的所有微生物的总量进行鉴定。