[发明专利]一种检测超低频基因突变的高通量测序文库的制备方法

权利要求书

1.一种检测超低频基因突变的高通量测序文库的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

A、以目标样品构建RNA或外显子组的反义链单链DNA文库；

B、以参照样品构建RNA或外显子组的编码链单链DNA文库；

C、将反义链单链DNA文库与编码链单链DNA文库进行杂交；

D、补齐杂交区与识别区的单链区域，以使限制性内切酶在识别区外下游切除完全杂交的杂交体，保留不能完全杂交或不能杂交的差异片断；

E、以不能完全杂交或不能杂交的差异片断为模板进行PCR扩增，纯化扩增产物，获得双链DNA高通量测序文库。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤A的RNA的反义链单链DNA文库的制备方法包括：以RNA为模板进行PCR扩增，获得RNA的反义链单链DNA文库，所述RNA的两端带有不同接头，且一端接头带有限制性内切酶识别位点，所述RNA的一端还带有引物。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤A的RNA的反义链单链DNA的序列长度为30～40bp。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤A的外显子组的反义链单链DNA文库的构建方法包括：以外显子组为模板进行PCR扩增，获得外显子组的反义链单链DNA文库。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤A的外显子组的反义链单链DNA文库的构建方法包括：所述外显子组的两端修复成平头并加上Y型平头连接接头，并利用高密度外显子组捕获试剂进行捕获基因编码链或反义链单链DNA；接着，用只捕获一端接头的DNA单链制剂再次捕获，以保证同一基因位点对应的单链DNA的5’端只有一种带有内切酶识别位点的接头。

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤B的RNA的编码链单链DNA文库的构建方法包括：

A、以RNA为模板进行PCR扩增，获得RNA的反义链单链DNA文库，所述RNA的两端带有不同接头，且一端接头带有限制性内切酶识别位点，所述RNA的一端还带有引物；

B、以步骤A获得的反义链单链DNA为模板进行不对称PCR扩增，获得RNA的编码链单链DNA文库；

C、用DNA限制性内切酶切除编码链单链DNA的至少一端的外源接头。

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤B的RNA的编码链单链DNA的序列长度为20～50bp。

8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤B的外显子组的反义链单链DNA文库的构建方法包括：

A、以外显子组为模板进行PCR扩增，获得外显子组的反义链单链DNA文库；

B、以步骤A获得的反义链单链DNA为模板进行不对称PCR扩增，获得外显子组的编码链单链DNA文库；

C、用DNA限制性内切酶切除编码链单链DNA的至少一端的外源接头。

9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述步骤B的外显子组的编码链单链DNA文库的构建方法包括：所述外显子组的两端修复成平头并加上Y型平头连接接头，并利用高密度外显子组捕获试剂进行捕获基因编码链或反义链单链DNA；接着，用只捕获一端接头的DNA单链制剂再次捕获，以保证同一基因位点对应的单链DNA的5’端只有一种带有内切酶识别位点的接头；最后，用DNA限制性内切酶切除编码链单链DNA的一端的外源接头。

10.如权利要求1-9任一所述的制备方法，其特征在于，所述以目标样品构建RNA或外显子组的反义链单链DNA文库替换为以目标样品构建RNA或外显子组的编码链单链DNA文库；所述以参照样品构建RNA或外显子组的编码链单链DNA文库替换为以参照样品构建RNA或外显子组的反义链单链DNA文库。