[发明专利]一种检测超低频基因突变的高通量测序文库的制备方法

说明书

本发明涉及一种检测超低频基因突变的高通量测序文库的制备方法，其主要特征为将目标细胞的RNA反转录为互补DNA，然后以合成或其它方式取得的RNA同义DNA，与互补DNA杂交，如果存在突变，那么突变区就不能完全杂交。由于DNA内切酶只能切割完全杂交的双链DNA而不能切除不完全杂交的双链DNA，所以我们可以用特定的内切酶切除完全杂交的DNA片断而保存不能完全杂交的DNA片断。然后将带有突变位点的不能完全杂交的而保留的DNA片断扩增，构建高通量测序库进行高通量测序。然后根据测序数据分析出突变位点。

技术领域

本发明属于生命科学和医学技术领域，具体地说，是关于一种RNA水平经济、准确、灵敏、稳定地检测在大量的正常细胞中混有极少量(低于1/1000)基因突变细胞(癌细胞)时突变细胞的突变基因的高通量测序文库的制备方法。

背景技术

研究表明，物种的进化、细胞变异都是由于微小的基因突变而导致不同的表型。就大型物种而言，每个物种的基因组约有数亿到数十亿个碱基数，而许多关键突变只有几个碱基甚至只有一个碱基。如果没有明确的目标，要从浩如烟海的基因组中，找到突变的碱基，就如大海捞针。用常规一代测序方法进行人类基因组的测序，需要花费数十亿美元。

随着近几年高通量测序技术的成熟，高通量测序已经成为基因研究及基因突变检测的常规有力武器，可以轻松实现一次测出数十亿到数百亿的碱基数，但其存在如下问题：一方面，其成本高，检测一次需要要数万元；另一方面，其检测难，如果待测样品中混有极少量的突变样品，那突变位点的碱基数相对于整个样品的碱基数而言，只有万亿分之一，纵然是高通量测序，也很难在没有明确基因目标的待测样品中检测出突变样品。

为了去除非突变干扰基因信息的影响，科学家们探索了多种方法。其中一类为差减杂交法，主要可分为两种：一种是利用参照样品的cDNA与目标样品mRNA杂交，然后纯化mRNA，此方法的mRNA获得效率低，且有可能去除目标样品中带有突变的mRNA,丢失需要检测的目标信息；另一种是只用目标样品构建高通量测序双链DNA文库高温变性后快速复性，样品中高丰度的DNA就由于随机碰撞能更多遇到配对序列因而更可能多的形成双链，然后用双链特异性DNA酶切除双链，此方法可以一定程度降低高丰度基因的丰度到1/10，但低丰度基因的丰度提高2-3倍，但对于样品中极少量突变细胞中的少数基因突变，这种方法完全无能为力，并且双链特异性DNA酶可以识别20bp以上的双链并切断，这样的话，单点突变的基因形成的杂合链由于部分区域形成20bp以上的双链，会被双链特异性DNA酶切断，因而有可能造成目标信息的丢失，不能达到精准甄别基因差异或基因表达差异的要求。

另一类为当前研究比较热门的单细胞法，将癌变或特异细胞从大量正常细胞中分离出来，再对单细胞进行高通量测序，但在应用过程中，单细胞的分离非常复杂，一方面需要昂贵的仪器，比如显微切割仪，单细胞分离仪、流式细胞仪等，另一方面，由于分离单细胞还需要一定的标记，而标记物对高通量测序存在一定的干扰作用，易造成假阳性或假阴性，影响实验结果。另外，单细胞分离及后续的实验处理等对实验技术条件及人员的要求非常高，成本高，普及难，不实用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种RNA水平经济、准确、灵敏、稳定地检测细微变异的品种、组织或细胞样品间超低频基因变的高通量测序文库的制备方法。

一种检测超低频基因突变的高通量测序文库的制备方法，包括如下步骤：

A、以目标样品构建RNA或外显子组的反义链单链DNA文库；

B、以参照样品构建RNA或外显子组的编码链单链DNA文库；

C、将反义链单链DNA文库与编码链单链DNA文库进行杂交；

D、补齐杂交区与识别区的单链区域，以使限制性内切酶在识别区外下游切除完全杂交的杂交体，保留不能完全杂交或不能杂交的差异片断；