[发明专利]一种牛乳中β-酪蛋白的纯化制备方法

权利要求书

1.一种牛乳中β-酪蛋白的纯化制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

a) 样品预处理：取新鲜牛乳液或溶解的牛乳粉，低温高速离心除去乳脂，采用0.5~1 M乙酸调节pH至酪蛋白等电点，室温下静置产生沉淀，低温离心取出沉淀物并加入缓冲液混匀、离心，取上清液过滤膜，得酪蛋白粗样；

b) 离子交换色谱纯化：将所述酪蛋白粗样上样到平衡缓冲液处理好的离子交换色谱柱上，上样后用平衡缓冲液继续淋洗色谱柱，待280 nm吸收值至基线，使用洗脱缓冲液进行洗脱，收集洗脱馏分进行SDS-PAGE电泳及HPLC分析检测，合并纯度高于80%以上的酪蛋白馏分；

c) 高效反相色谱精细纯化：对步骤b）中合并的酪蛋白馏分进行高效反相色谱纯化制备，收集各洗脱峰馏分，采用SDS-PAGE电泳及HPLC分析检测，合并纯度高于95%的β-酪蛋白馏分；

d) 脱盐及干燥后处理：采用G25凝胶色谱对步骤c）中合并的β-酪蛋白馏分进行脱盐处理，对脱盐后的样品进行干燥处理，得β-酪蛋白冻干粉。

2.根据权利要求1所述的一种牛乳中β-酪蛋白的纯化制备方法，其特征在于，所述步骤a)中，取新鲜牛乳液或溶解的牛乳粉，在4℃条件下离心10000 rpm，15 min，除去乳脂，采用0.5~1 M乙酸调节pH至4.5-4.7，室温下静置30min产生沉淀，在4℃条件下离心10000 rpm，15 min，取出沉淀物并加入pH7.5的20mM磷酸钠缓冲液或者加入pH7.5的20mMTris-HCl缓冲液，混匀、离心，取上清液过滤膜，得酪蛋白粗样。

3.根据权利要求1所述的一种牛乳中β-酪蛋白的纯化制备方法，其特征在于，所述步骤b)中，离子交换色谱纯化所用的分离材料基质为琼脂糖或高分子聚合物；粒径为30-100μm；配基的基团为-CH₂N^＋(CH₃)₃或-OCH₂CH₂N^＋H(CH₂CH₃)₂或-CH₂CHOHCHH₂N^＋H(CH₂CH₃)₂。

4.根据权利要求1所述的一种牛乳中β-酪蛋白的纯化制备方法，其特征在于，所述步骤b)中，离子交换色谱纯化过程中平衡缓冲液的电导率为0-10 mS/cm、pH为 7.5-9.0；洗脱缓冲液的电导率为 10-90 mS/cm、pH为7.5-9.0；洗脱方式为等度洗脱和/或梯度洗脱；梯度洗脱：流动相中盐浓度电导率在10-100 min内由20 mS/cm变为90 mS/cm，洗脱体积为柱体积的3-8倍。

5.根据权利要求1所述的一种牛乳中β-酪蛋白的纯化制备方法，其特征在于，所述步骤c)中，高效反相色谱精细纯化所用的填料基质为硅胶或高分子聚合物；填料配基的碳原子数为4-20的正链烷基中的一种或多种；填料粒径为5-80μm，孔径为200-500Å，比表面积为100~500 m²/g；色谱柱内径为4.6-1600 mm，柱床高度为50-1000 mm。

6.根据权利要求1所述的一种牛乳中β-酪蛋白的纯化制备方法，其特征在于，所述步骤c)中，高效反相色谱精细纯化中上样量为色谱固定相重量的0.01-20 %；色谱的上样和洗脱流速为50-200 cm/h；起始有机溶剂的含量为3-40 %；洗脱方式为等度洗脱和/或梯度洗脱；梯度洗脱：流动相中有机相与盐相的体积比在10-200 min内由5:95-40:60变为40:60-95:5。

7.根据权利要求1所述的一种牛乳中β-酪蛋白的纯化制备方法，其特征在于，所述步骤d)中，对脱盐后的样品进行离心浓缩干燥或冷冻干燥或低温真空干燥。