[发明专利]一种牛乳中β-酪蛋白的纯化制备方法

说明书

本发明公开了一种牛乳中β‑酪蛋白的纯化制备方法，包括a)样品预处理：采用低温离心去脂和等电点沉淀除去乳清蛋白，得酪蛋白粗样；b)离子交换色谱纯化：收集洗脱馏分进行SDS‑PAGE电泳及HPLC分析检测，合并纯度高于80%的酪蛋白馏分；c)高效反相色谱精细纯化：对步骤b)中合并的酪蛋白馏分进行反相色谱纯化制备，收集各洗脱峰馏分，采用SDS‑PAGE电泳及HPLC分析检测，合并纯度高于95%的β‑酪蛋白馏分；d)脱盐及干燥处理：采用G25凝胶色谱对步骤c)中合并的β‑酪蛋白馏分进行脱盐处理，对脱盐后样品进行干燥处理，得β‑酪蛋白冻干粉。本发明方法收率高、稳定性好、条件温和且易于放大生产，另外也能够为后续研究β‑酪蛋白及乳品中标准蛋白检测提供高纯度对照品。

技术领域

本发明涉及酪蛋白提取纯化领域，具体涉及一种牛乳中β-酪蛋白的纯化制备方法。

背景技术

牛乳是目前市售大部分婴儿配方奶粉的主要原料，用牛乳为基础生产的配方奶粉人工喂养逐渐成为无法母乳喂养的第一选择，然而牛乳和母乳蛋白质存在着较大差异，牛乳中的酪蛋白主要是α_s-酪蛋白，而母乳中的酪蛋白则以β-酪蛋白为主，几乎不含α_s-酪蛋白，牛乳酪蛋白与乳清蛋白含量比例为80:20，而母乳为40:60。牛乳中的大量α_s-酪蛋白在婴儿胃中易形成颗粒较大的酪蛋白胶束，婴儿活性较低的胃蛋白酶难以消化蛋白质凝块，而以β-酪蛋白为主的母乳酪蛋白几乎没有凝块。

β-酪蛋白是一种磷酸化蛋白质，可以被降解成多种具有生物活性的肽段，从而会更好地被婴儿吸收，并能促进矿物质在人体内的消化与吸收，对婴幼儿的骨骼和神经系统的发育具有重要的影响。β-酪蛋白含有人体必须的8种氨基酸，在人体消化过程中，能够引起消化代谢、激素、免疫、神经和营养等多方面的应答，研究表明β-酪蛋白能够大大降低过敏性，具有抗高血压、抗病毒的功能，并能防止活性蛋白变异。

为了模拟母乳成分，配方奶粉就需增加乳清蛋白含量的同时也提高β-酪蛋白的含量，并减少α_s-酪蛋白的含量。故研究β-酪蛋白以及如何将其与乳清蛋白以及其他种类的酪蛋白如α_s1-酪蛋白、α_s2-酪蛋白和κ-酪蛋白分级分离，提高β-酪蛋白在牛乳酪蛋白中的占比，对牛乳中的β-酪蛋白进行定量，对生产更加接近母乳的配方奶粉有十分重要的意义。

发明内容

有鉴于此，本发明期望提供一种牛乳中β-酪蛋白的纯化制备方法，采用低温离心、等电点沉淀、离子交换、SDS-PAGE电泳分析及反相色谱技术实现乳清蛋白与酪蛋白的分离以及不同种类酪蛋白的分离，制备的β-酪蛋白纯度高、稳定性好、条件温和且易于放大生产；另外本发明方法可应用于β-酪蛋白标准品的制备，也可用于以牛乳为原料的乳制品婴幼儿食品的生产。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

本发明一种牛乳中β-酪蛋白的纯化制备方法，包括以下步骤：

a)样品预处理：取新鲜牛乳液或溶解的牛乳粉，低温高速离心除去乳脂，采用0.5～1M乙酸调节pH至酪蛋白等电点，室温下静置产生沉淀，低温离心取出沉淀物并加入缓冲液混匀、离心，取上清液过滤膜，得酪蛋白粗样；

b)离子交换色谱纯化：将所述酪蛋白粗样上样到平衡缓冲液处理好的离子交换色谱柱上，上样后用平衡缓冲液继续淋洗色谱柱，待280nm吸收值至基线，使用洗脱缓冲液进行洗脱，收集洗脱馏分进行SDS-PAGE电泳及HPLC分析检测，合并纯度高于80％以上的酪蛋白馏分；

c)高效反相色谱精细纯化：对步骤b)中合并的酪蛋白馏分进行高效反相色谱纯化制备，收集各洗脱峰馏分，采用SDS-PAGE电泳及HPLC分析检测，合并纯度高于95％的β-酪蛋白馏分；

d)脱盐及干燥后处理：采用G25凝胶色谱对步骤c)中合并的β-酪蛋白馏分进行脱盐处理，对脱盐后的样品进行干燥处理，得β-酪蛋白冻干粉。