[发明专利]血浆中氧化三甲胺含量的检测方法及检测试剂盒

说明书

本发明涉及血浆中氧化三甲胺含量的检测方法及检测试剂盒。具体地，本发明提供一种用于通过液质联用检测血样中氧化三甲胺的蛋白沉淀剂，所述的蛋白沉淀剂包括：(i)组分A，所述的组分A为乙醇；(ii)组分B，所述的组分B为乙腈；和(ii)组分C，所述的组分C为甲酸；所述的组分A、组分B和组分C的体积比(v/v/v)依次为(22‑40)：(60‑78)：(0.2‑0.8)。本发明所述的蛋白沉淀剂对血浆进行前处理后，既能提高TMAO从血样中的释放率，又能降低离子抑制率，从而降低TMAO的损失，提高液质联用检测的准确度和降低高效液相‑质谱被污染的风险，从而避免在处理血样导致错误的诊断结果。

技术领域

本发明涉及医学生物检测技术领域，具体地涉及血浆中氧化三甲胺含量的检测方法及检测试剂盒。

背景技术

心血管疾病目前是中国城乡居民死亡原因的首位，高于肿瘤和其他疾病。最新发布的《中国心血管病报告2017》数据表明：中国心血管病患病率及死亡率仍处于持续上升阶段，推算全国有心血管病患者2.9亿，其中脑卒中1300万，冠心病1100万，肺心病500万，心力衰竭45万，风心病250万，高血压2.7亿。中国30％的人口存在≥3个心血管危险因素，即近4亿人口同时存在≥3个心血管危险因素。我国心血管病防治工作已取得初步成效但仍面临严峻挑战。总体上看，中国心血管病患病率及死亡率仍处于上升阶段。心血管病死亡占城乡居民疾病死亡构成的40％以上，居首位，高于肿瘤及其他疾病。心血管病的疾病负担日渐加重，已成为重大的公共卫生问题，在政府发布的《中国慢性病防治工作规划》中就明确指出：慢病防治最关键的部分就在于提高疾病的风险预测，即做到早发现、早治疗。氧化三甲胺(TMAO)是由肠道细菌消化红肉、鸡蛋、乳制品、咸水鱼收后，再经过肝脏加工产生的一种极性小分子化合物。近年来，随着肠道菌群研究的深入，科学家们发现TMAO与心血管疾病、脑卒中、糖尿病、慢性肾病、癌症等多种疾病密切相关，因此TMAO越来越受到广泛关注。TMAO是一个新型的预测心脑血管疾病风险的生物标记物，能很好的独立预测心脑血管疾病的风险。TMAO定量分析可为心脑血管疾病的诊断、风险分层和预测等方面提供可靠的依据。TMAO浓度升高与主要不良心血管事件的风险是呈现显著相关性的，并且相对风险的增加不随身体质量指数、糖尿病、心血管疾病史、肾功能障碍等因素的变化而变化，并且可在通过传统危险因素以及血液检测无法识别的人群中作为预测将来心脏病发作、脑卒中和死亡风险的一种准确筛查工具。代谢小分子氧化三甲胺检测与胆固醇、甘油三酯或血糖水平一样有助于指导临床医师提供个体化营养建议以预防心血管疾病。

传统的TMAO检测方法为分光光度法、毛细管电泳法及色谱法，其灵敏度和准确度有限、重复性差。液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)具有分析时间短、灵敏度高、特异性高等优点，显示极高优越性和应用前景，是目前TMAO检测最常用的方法。可利用稳定同位素标记化合物作为内标，有效消除基质干扰，极大的提高特异性。

目前已报道串联质谱法检测TMAO文献及专利中使用的蛋白沉淀剂，主要是甲醇或乙腈。一般用甲醇沉淀蛋白的优点是增加血浆中待测小分子的释放率，避免待测物质的损失，但同时也因提取过多的内源性杂质而造成很强的离子抑制，即在血浆样本中的氘代内标信号要比在空白溶剂中的内标信号低一些。因为空白溶剂中的基质比较干净，对离子的抑制不明显，通过氘代内标在血浆样本中的响应与其在空白样本中的响应之差，该差与氘代内标在空白样本中的响应比值来计算离子抑制。如果离子抑制太大，说明血浆前处理不干净，长期会造成色谱柱和仪器的污染、堵塞，严重降低色谱柱和仪器的使用寿命。

乙腈与之相反，沉淀能力比甲醇强，离子抑制会明显减弱，但在处理临床高脂血浆样本时容易导致待测物质损失，从而导致错误的诊断。

目前蛋白沉淀法的离子抑制一般都很强，即经过蛋白沉淀前处理后的上机液对色谱柱及质谱仪的影响较大。因此，需提供一种综合性能较强的蛋白沉淀剂，既能有效的降低色谱柱及质谱仪的污染，又可避免在处理高脂血浆样本时导致错误的诊断。此外，目前已报道串联质谱法检测TMAO文献及专利中的检测速度较慢，一般在2.5-20min，需要开发更快的检测方法来满足临床大批量样本快速检测的需求。