[发明专利]维生素B

权利要求书

1.一种维生素B₂中生产菌株残留活菌及孢子的qPCR检测引物，所述生产菌株为枯草芽孢杆菌B.subtilis KCCM-10445，其特征在于引物的核苷酸序列为：正向引物为5’-CGA GCTTTT GCG CGT ATA-3’，其反向引物为5’-GCC ATT CCAATA CAAAAC CACATA-3’。

2.一种维生素B₂中生产菌株残留活菌及孢子的qPCR检测探针，其特征在于：探针序列为FAM-CGGATC TAACGCATG CTC CGCA-BBQ。

3.一种维生素B₂中生产菌株残留活菌及孢子的检测方法，其特征在于：包括权利要求1所述的引物、权利要求2所述的探针和qPCR扩增组件，挑取抗性平板培养基上的菌，提取待测细菌的基因组DNA，以基因组DNA为模板，采用所述的扩增组件进行扩增，根据采用所述引物和探针能否实现所述基因组DNA为模板的阳性扩增进行判断。

4.根据权利要求3所述的维生素B₂中生产菌株残留活菌及孢子的检测方法，其特征在于：qPCR在25μL的PCR反应体系中进行；PCR反应体系中含有12.5μL 2x Taq TM探针混合液、每个引物0.4mM、0.1mM探针和2μL模板DNA，qPCR扩增热循环条件为先在95℃变性10min，然后再经过45个94℃变性40s、60℃复性延伸的循环扩增出目的片段。

5.根据权利要求3所述的维生素B₂中生产菌株残留活菌及孢子的检测方法，其特征在于：鉴别平板培养基上活菌及孢子是否存在残留的方法为，往含有不同氯霉素浓度的平板计数培养基中加入的活化菌液，进行培养，且延长培养时间促进细菌生产，同时以生产菌株作为阳性对照，确定能抑制样品杂菌生长的最低氯霉素浓度即为氯霉素最小选择压力，再采用抗性平板计数培养基鉴别生产菌株活菌及孢子是否存在残留。

6.根据权利要求3所述的维生素B₂中生产菌株残留活菌及孢子的检测方法，其特征在于：检测平板培养基上的菌为活菌的方法，将10g样品加入到90mL蛋白胨缓冲液中混合均匀；取1mL样品匀液加入到氯霉素抗性平板中倒置培养，同时以生产菌株作为阳性，蛋白缓冲液作为阴性对照。

7.根据权利要求3所述的维生素B₂中生产菌株残留活菌及孢子的检测方法，其特征在于：检测平板培养基上的菌为孢子的方法，将10g样品加入到90mL蛋白胨缓冲液中混合均匀；60℃条件下热处理30min，诱导枯草芽孢杆菌的芽孢萌发；取1mL样品匀液加入到氯霉素抗性平板中倒置培养，同时以生产菌株作为阳性，蛋白缓冲液作为阴性对照。