[发明专利]维生素B

说明书

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及维生素B₂中生产菌株残留活菌及孢子的qPCR检测方法及所用引物和探针。本发明设计了一种维生素B₂中生产菌株残留活菌及孢子的qPCR检测引物，所述生产菌株为枯草芽孢杆菌B.subtilis KCCM‑10445，引物的核苷酸序列为：正向引物为5’‑CGA GCT TTT GCG CGT ATA‑3’，其反向引物为5’‑GCC ATT CCA ATA CAA AAC CAC ATA‑3’，以及探针、试剂盒和检测方法。本发明能精确检测维生素B₂产品中枯草芽孢杆菌B.subtilis KCCM‑10445生产菌株残留活菌及孢子，并开发了一种检测所涉及的引物、探针及检测方法。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及维生素B₂中生产菌株残留活菌及孢子的qPCR检测方法及所用引物和探针。

背景技术

维生素B₂又叫核黄素，微溶于水，在中性或酸性溶液中加热是稳定的。为体内黄酶类辅基的组成部分(黄酶在生物氧化还原中发挥递氢作用)，当缺乏时，就影响机体的生物氧化，使代谢发生障碍，导致多种疾病，是生命活动不可缺少的维生素。对于人和动物来说，必须从食物中获取维生素B₂。人体每天大约需要0.3-1.8mg维生素B₂，而动物饲料中必须含有1-4mg/kg的维生素B₂才能满足其生长需要并提高营养的利用率。

目前维生素B₂的生产途径主要采用微生物发酵法，主要使用的生产菌种有阿舒氏假囊酵母(Eremothecium ashbyii)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等，其中，枯草芽孢杆菌是一类广泛分布革兰氏阳性杆状好养型细菌，可形成内生抗逆芽胞，无致病性，环境兼容性好，而且还具有良好的发酵基础等优点被作为最常用的生产菌株。由于天然菌株合成维生素B₂的生产效率低，对其进行基因改造缩短发酵周期、提高维生素B₂的产量是常用的方法，但是基因工程菌在构建过程中，通常需要引入外源抗性基因作为筛选标记。

转基因菌株在产品中的残留可能会使人和动物产生致病性、致癌、致突变；且其携带的抗性基因可能会在环境中转移导致人和动物对抗生素等药物产生抗性；转基因微生物或质粒上携带的抗药性基因也有可能通过基因转移而使得其他与人类和动物关系密切的致病性微生物获得该基因；另外，转基因微生物的转移也会对生态环境造成不利影响。活菌残留检测是一种对产品质量及安全性评估的有效方法，可以有效预防转基因微生物的转移对人、动物和生态环境造成危害。因此，对维生素B₂产品中进行GM B.subtilis活菌及孢子进行残留检测是非常必要的，要严格控制微生物发酵产品的质量，保护产品的安全性和使用安全性。

常用的细菌活菌检测方法为平板培养法、代谢产物检测法、信使RNA法，但是这类方法只能检测活菌，不能特异性鉴别某一种菌株的残留，此外，有关孢子检测方面的内容很少。因此灵敏度高、特异性强、高通量和定量准确的实时荧光定量PCR技术被广泛应用于定性、定量检测致病菌、DNA残留等。人们常用16S rRNA基因序列分析法鉴定细菌，但是该方法操作繁琐，对转基因菌株的鉴别具有局限性，且枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌的16S rRNA基因相似度达到99％以上，无法用该方法进行区分，因此我们采用GMB.subtilis菌株的特有序列设计出qPCR的引物和探针，可特异性鉴别生产菌株的残留。

发明内容