[发明专利]一种苯酚识别SERS探针及其制备、应用和基于SERS通用超灵敏免疫分析方法

权利要求书

1.一种基于表面增强拉曼散射的通用超灵敏ELISA免疫分析方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将特异性识别抗原分子的第一抗体分子通过孵育固定于孔板基底，由于结合孔板基底的第一抗体分子仍具有免疫活性，加入相应的抗原分子进行免疫反应，然后再加入ALP标记的第二抗体分子，与抗原分子通过免疫反应形成抗原抗体分子键结的免疫反应结构；

（2）将步骤（1）具有免疫反应结构的抗体抗原分子与PPNa溶液混合均匀，室温下孵育5～30min，使第二抗体分子上的ALP分解PPNa产生苯酚，然后加入SERS探针，继续孵育10～30min，最后进行SERS检测；

其中第二抗体分子、抗原分子和特异性识别抗原分子的第一抗体分子均属同一种生物分子，所述生物分子为细菌、细胞、病毒、DNA和RNA中的一种；

所述SERS探针为苯酚响应型表面增强拉曼散射探针，由以下方法制备得到：

a、将氯金酸水溶液溶于盐酸中，然后加入聚乙烯吡咯烷酮，冰水浴条件下反应5～20min，加入3-脒基-苯胺，混合均匀，2～8℃下静置反应12～48h，离心洗涤，得到金微米粒子CLMPs；

b、在冰水浴条件下，将亚硝酸钠加入到2,2'-二硫二苯胺盐酸水溶液中，反应0.5～2h后，加入四氟硼酸钠，得到2,2'-二硫二苯氮四氟硼酸，即为特异性识别苯酚的拉曼分子；

c、将DTDBD溶于溶剂中，加入金微米粒子CLMPs水溶液，混合均匀，在2～8℃孵育0.5～4h后，洗涤，得到DTDBD-CLMPs，即为苯酚响应型表面增强拉曼散射探针。

2.根据权利要求1所述一种基于表面增强拉曼散射的通用超灵敏ELISA免疫分析方法，其特征在于，步骤（2）所述PPNa溶液的浓度为0.5～3mmol/L，溶剂为水；所述PPNa溶液中的PPNa与具有免疫反应结构的抗体抗原分子中的第二抗体分子的质量比为1：（2～10）；所述SERS探针数量和PPNa溶液中PPNa的摩尔量比为1个：（4.5×10^-5～1.8×10^-4）mmol；

步骤（2）所述SERS探针以SERS探针水溶液的形式加入，所述SERS探针水溶液中SERS探针的含量为50～200个/mL。

3.根据权利要求1所述一种基于表面增强拉曼散射的通用超灵敏ELISA免疫分析方法，其特征在于，步骤a所述氯金酸水溶液的质量浓度为5～25%；所述盐酸的浓度为1 mmol/L，所述氯金酸水溶液与盐酸的体积比为1：125；

步骤a所述氯金酸水溶液中的氯金酸、聚乙烯吡咯烷酮和3-脒基-苯胺的质量比为1：（1～3.2）：（2～10）；

步骤b所述亚硝酸钠、2,2'-二硫二苯胺盐酸水溶液中2,2'-二硫二苯胺和四氟硼酸钠的摩尔比为1：（0.2～1）：（20～30）；

步骤c所述DTDBD摩尔量和金微米粒子CLMPs水溶液中金微米粒子CLMPs的个数比为（2.5×10^-3～6×10^-2）mmol：1个。

4.根据权利要求1所述一种基于表面增强拉曼散射的通用超灵敏ELISA免疫分析方法，其特征在于，步骤b所述2,2'-二硫二苯胺盐酸水溶液由以下方法制得：将2,2'-二硫二苯胺溶于盐酸中，得到2,2'-二硫二苯胺盐酸水溶液，其中2,2'-二硫二苯胺在盐酸中的浓度为0.03～1.5 mol/L，盐酸的浓度为0.5～2 mol/L；

步骤b所述四氟硼酸钠以饱和四氟硼酸钠水溶液的形式加入；

步骤c所述DTDBD在溶剂中的浓度为5～30 mmol/L；所述金微米粒子CLMPs水溶液中金微米粒子CLMPs的含量为50～200个/mL；

步骤c所述溶剂为二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙醇、甲醇中的至少一种。