[发明专利]一种苯酚识别SERS探针及其制备、应用和基于SERS通用超灵敏免疫分析方法

说明书

本发明公开了一种苯酚识别SERS探针及其制备、应用和基于SERS通用超灵敏免疫分析方法。先利用DTDBA还原氯金酸制备一种苯酚响应型SERS探针，然后将ELISA与SERS联用，用ALP标记生物分子，利用ALP水解其底物PPNa产生苯酚，通过苯酚引起的SERS探针信号从而达到灵敏检测生物分子的技术。该技术既能够克服常规酶联免疫分析灵敏度低的缺点，又能够解决SERS检测信号增强和重现性差的问题。本发明具有显著地普适性，可广泛应用于以ALP作为酶标记的免疫分析测定多种生物分子，为基于SERS检测的免疫技术发展打下坚实的基础，在生物、化学检测，医学诊断等领域都有很大的发展空间和广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于生物分子检测技术领域，具体涉及一种苯酚识别SERS探针及其制备、应用和基于SERS通用超灵敏免疫分析方法。

背景技术

传统的酶联免疫吸附测定(ELISA)是利用抗原抗体之间专一性键结特性，基于“三明治”策略，设计其键结机制，以酶标记第二抗体分子。利用酶的催化性能使其相应的底物发生颜色或荧光变化，即可显示特定抗原或抗体是否存在，通过测定相应的光学强度变化进行定量分析，对待测物进行检测。但是受限于这些光谱方法的灵敏度，ELISA免疫分析的灵敏度亟待提高，因此该技术较难应用于痕量或超痕量生物分子检测。表面增强拉曼散射(Surface Enhanced Raman Scattering，SERS)是将激光拉曼光谱应用于表面化学研究中发现的一种新的表面光学现象。SERS凭借其超高的灵敏度、独一无二的指纹谱、窄峰宽及无水干扰等特点，成为一种广泛采用的检测手段，可用于痕量分析乃至单分子检测。SERS探针是指单个纳米粒子上修饰拉曼分子，具有灵敏度高、抗光漂白、指纹识别能力强、稳定性好及多重检测等优点，为高灵敏生物分析检测提供了可能。然而，SERS光谱检测仍存在不足，譬如绝大多数采用的基于简单纳米结构的金银或其合金形成的基底，由于缺乏丰富的“热点”区域使得拉曼信号增强不够；此外，SERS基底具有较随机的结构，即便是同批制备的基底，彼此之间的SERS增强因子差别仍可能较大，使得SERS信号的均一性不佳；再者，溶液相中游离态的被检测物在SERS基底上的自发吸附较弱，也将造成拉曼信号较弱。此外，SERS检测时信号无规律波动的问题亟待解决，SERS信号重复性与可靠性有待于提高。

发明内容

为解决现有技术的缺点和不足，本发明的首要目的在于提供一种苯酚响应型表面增强拉曼散射(SERS)探针的制备方法。

本发明的另一目的在于提供上述方法制得的一种苯酚响应型表面增强拉曼散射(SERS)探针。

本发明的再一目的在于提供上述一种苯酚响应型表面增强拉曼散射(SERS)探针的应用。

本发明的再一目的在于提供一种基于表面增强拉曼散射(SERS)的通用超灵敏ELISA免疫分析方法。

本发明目的通过以下技术方案实现：

一种苯酚响应型表面增强拉曼散射(SERS)探针的制备方法，包括以下步骤：

(1)将氯金酸水溶液溶于盐酸中，然后加入聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，冰水浴条件下反应5～20min，加入3-脒基-苯胺(NAAN)，混合均匀，2～8℃下静置反应12～48h，离心洗涤，得到金微米粒子CLMPs；

(2)在冰水浴条件下，将亚硝酸钠加入到2,2'-二硫二苯胺(DTDBA)盐酸水溶液中，反应0.5～2h后，加入四氟硼酸钠，得到2,2'-二硫二苯氮四氟硼酸(DTDBD)，即为特异性识别苯酚的拉曼分子；

(3)将DTDBD溶于溶剂中，加入金微米粒子CLMPs水溶液，混合均匀，在2～8℃孵育0.5～4h后，洗涤，得到DTDBD-CLMPs，即为苯酚响应型表面增强拉曼散射(SERS)探针。

步骤(1)所述氯金酸水溶液的质量浓度为5～25％；所述盐酸的浓度为1mmol/L，所述氯金酸水溶液与盐酸的体积比为1：125；所述盐酸指盐酸水溶液。