[发明专利]一种纤维素及石油烃降解细菌的分离方法

权利要求书

1.一种纤维素及石油烃降解细菌的分离方法，包括步骤：

(1)富集培养：取常年落有草木、秸秆、落叶的森林土壤溶于葡萄糖与羧甲基纤维素混合水溶液中制成土壤悬液，将土壤悬液采用浓度梯度法接种于富集培养基上，培养直至出现单菌落，将单菌落采用平板划线法转移至羧甲基纤维素为唯一碳源的培养基平板上进行纯化，直至出现单菌落；

(2)复筛：将步骤(1)得到的单菌落在羧甲基纤维素为唯一碳源的培养基平板上连续转移传代3～5次，至菌落稳定生长；

(3)定向筛选：将步骤(2)得到的单菌落转移至以微晶纤维素粉为唯一碳源培养基平板上，直至出现单菌落，连续传代3～5次，至菌落稳定生长；

(4)原油降解细菌目标筛选：将步骤(3)得到的单菌落通过平板划线法转移至原油培养基平板上，培养至单菌落出现，将原油培养基平板上生长的单菌落传代5代，稳定遗传的菌株保存至-80℃待用；

(5)菌种鉴定：扩增步骤(4)得到的单菌落的16SrDNA，将16SrDNA通过BLAST与EZbiocloud比对鉴定，比对后为细菌菌属的保留，其他真菌菌属舍弃。

2.根据权利要求1所述的纤维素及石油烃降解细菌的分离方法，其特征在于，所述富集培养基的配方为0.5gKNO₃，0.5gKH₂PO₄，0.4gMgSO₄.7H₂O，0.01gFeSO₄.7H₂O，0.5g葡萄糖，pH7.0～7.2。

3.根据权利要求1所述的纤维素及石油烃降解细菌的分离方法，其特征在于，所述羧甲基纤维素为唯一碳源培养基的配方为0.5gKNO₃，0.5gKH₂PO₄，0.4gMgSO₄.7H₂O，0.01gFeSO₄.7H₂O，3g羧甲基纤维素钠，pH7.0～7.2。

4.根据权利要求1所述的纤维素及石油烃降解细菌的分离方法，其特征在于，所述微晶纤维素粉为唯一碳源培养基的配方为0.5gKNO₃，0.5gKH₂PO₄，0.4gMgSO₄.7H₂O，0.01gFeSO₄.7H₂O，3g微晶纤维素粉，pH7.0～7.2。

5.根据权利要求1所述的纤维素及石油烃降解细菌的分离方法，其特征在于，所述原油培养基的配方为1.0gNH₄NO₃，2.0gK₂HPO₄，1.0gKH₂PO₄，0.05g0.05gMgSO₄.7H₂O，0.01gCaCl₂，蒸馏水定容至1000mL，灭菌待用，灭菌后的培养基添加原油0.5～1.0g/L。

6.根据权利要求1所述的纤维素及石油烃降解细菌的分离方法，其特征在于，所述步骤(5)中扩增16SrDNA的过程为，扩增引物为16S通用引物：27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG与1492R AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；扩增反应体系如下：10×PCR反应缓冲液5μl，25mmol/LMgSO₄ 2μl,10mmol dNTP 5μl,10nmol/L引物各1μl，菌落为DNA模板，KoD-Plus DNA聚合酶1μl，双蒸去离子水定容至50μl。反应条件为：95℃预变性5min；95℃30s，50℃30s，68℃延伸2.00min，共计30个循环；68℃延伸10min；15℃保持10min。扩增序列测序由ABI3100测序仪完成。