[发明专利]一种纤维素及石油烃降解细菌的分离方法

说明书

本发明涉及微生物分离技术领域，尤其涉及纤维素及石油烃降解细菌的分离方法。纤维素及石油烃降解细菌的分离方法，包括步骤：(1)富集培养：取常年落有草木、秸秆、落叶的森林土壤，采用浓度梯度法接种于富集培养基上，培养直至出现单菌落，转移至羧甲基纤维素为唯一碳源平板上进行纯化，直至出现单菌落；(2)复筛：将单菌落在羧甲基纤维素为唯一碳源平板上连续传代；(3)定向筛选：单菌落转移至以微晶纤维素粉为唯一碳源平板上，直至出现单菌落，连续传代；(4)原油降解细菌目标筛选：将单菌落通过平板划线法转移至原油平板上，培养至单菌落出现；(5)菌种鉴定：扩增单菌落的16SrDNA，将16SrDNA比对鉴定，比对后为细菌菌属的保留。

技术领域

本发明涉及微生物分离技术领域，尤其涉及纤维素及石油烃降解细菌的分离方法。

背景技术

纤维素是自然界中分布最广、数量最多的可再生资源，随着化石燃料的日益枯竭及环境污染问题的凸显，天然纤维素的开发引起了科学家的广泛关注。天然纤维素如何转化为可供人们利用的能源成为困扰人们的一个新的课题。很多微生物具有降解石油的能力，并且在自然界中广泛分布，而引起科学家的广泛关注。目前，天然纤维素的处理大多采用焚烧或者自然腐烂的方式，严重污染环境，并造成了极大浪费。同时，随着工业化进程的加速，石油污染也成为困扰人们的一大难题，微生物降解石油也成为科学研究的一个热点。所以发现既能够降解纤维素又能够降解石油的菌株对环境的保护具有深远意义。

发明内容

为了解决以上问题，本发明的目的是提供一种纤维素及石油烃降解细菌的分离方法，得到的细菌既能降解纤维素又能降解石油烃。

为实现上述目的，本发明所设计的纤维素及石油烃降解细菌的分离方法，包括步骤：

(1)富集培养：取常年落有草木、秸秆、落叶的森林土壤溶于葡萄糖与羧甲基纤维素混合水溶液中制成土壤悬液，将土壤悬液采用浓度梯度法接种于富集培养基上，培养直至出现单菌落，将单菌落采用平板划线法转移至羧甲基纤维素为唯一碳源的培养基平板上进行纯化，直至出现单菌落；

(2)复筛：将步骤(1)得到的单菌落在羧甲基纤维素为唯一碳源的培养基平板上连续转移传代3～5次，至菌落稳定生长；

(3)定向筛选：将步骤(2)得到的单菌落转移至以微晶纤维素粉为唯一碳源培养基平板上，直至出现单菌落，连续传代3～5次，至菌落稳定生长；

(4)原油降解细菌目标筛选：将步骤(3)得到的单菌落通过平板划线法转移至原油培养基平板上，培养至单菌落出现，将原油培养基平板上生长的单菌落传代5代，稳定遗传的菌株保存至-80℃待用；

(5)菌种鉴定：扩增步骤(4)得到的单菌落的16SrDNA，将 16SrDNA通过BLAST与EZbiocloud比对鉴定，比对后为细菌菌属的保留，其他真菌菌属舍弃。

与现有微生物分离技术相比，首先，本发明取自常年落有草木、秸秆、落叶的森林土壤作为材料，常年落有草木、秸秆、落叶的森林土壤中富含较多能降解纤维素的细菌，更容易分离得到降解纤维素的细菌；其次，采用羧甲基纤维素为唯一碳源的培养基平板和微晶纤维素粉为唯一碳源培养基平板依次筛选降解纤维素的细菌，能够准确得到降解纤维素的细菌；最后，采用原油培养基平板筛选既能降解纤维素又能降解石油烃的细菌。

作为优选方案，富集培养基的配方为0.5gKNO₃，0.5gKH₂PO₄， 0.4gMgSO₄.7H₂O，0.01gFeSO₄.7H₂O，0.5g葡萄糖，pH7.0～7.2。