[发明专利]一种控制甘蓝型油菜种子种皮颜色的基因、甘蓝型油菜黄籽突变体材料的获取方法及其应用

说明书

本发明属于油菜分子育种技术领域，尤其涉及一种控制甘蓝型油菜种子种皮颜色的基因、甘蓝型油菜黄籽突变体材料的获取方法及其应用。本发明利用CRISPR/Cas9技术靶向BnTT8同源基因，通过遗传转化得到突变体单株，经过自交分离，获得了不含T‑DNA插入的双拷贝纯合突变体。该突变体的种子表现为黄籽，显微观察种子的横切面发现，双纯合突变体的内种皮没有原花色素的积累，而单纯合突变体和野生型的内种皮中均包含有清晰可见的原花色素积累。对这些突变体进行品质分析发现，BnTT8基因的双拷贝纯合突变体含油量显著增加。BnTT8基因对于油菜种子的品质改良具有巨大的应用潜力和前景，为油菜品质育种提供新的种质资源。

技术领域

本发明属于油菜分子育种技术领域，尤其涉及一种控制甘蓝型油菜种子种皮颜色的基因、甘蓝型油菜黄籽突变体材料的获取方法及其应用。

背景技术

甘蓝型油菜是仅次于大豆和油棕的世界第三大油料作物，约占全球植物油总产量的 16％。它不仅为人类饮食提供食用油和高品质的动物饲料蛋白，而且还为生物柴油生产等工业生产过程提供原料。因此，提高含油量及品质一直是油菜生产的主要育种目标。目前，大多数商业油菜品种的种子颜色都是棕黑色。已有研究表明，黄籽甘蓝型油菜具有种皮薄、纤维素含量低、含油量高、饼粕蛋白质含量高等诸多优点。虽然甘蓝型油菜的二倍体祖先均具有黄色种子表型，且表型稳定，可以稳定遗传，但天然缺乏甘蓝型油菜黄籽突变体，因此，高含油量育种逐渐成为现代油菜的重要组成部分。开发高含油量高品质油菜品种将带来显著的经济效益。

与拟南芥类似，油菜种皮颜色的形成主要是由于一种被称为原花色素的黄酮类化合物氧化产生。在芸薹属植物中原花色素位于内种皮的内皮层，原花色素合成通过苯丙烷途径到类黄酮途径形成原花色素的前体花青素，进而形成原花色素。在种子成熟过程中，表儿茶素等无色的原花色素前体物质聚合氧化形成深褐色的原花色素，使种子颜色变成深褐色或黑色。黄籽油菜的种皮不合成积累原花色素，因此产生出黄籽的表型。

在多种作物的研究中TT8被认为是控制类黄酮积累的具有高保守性的重要基因。已有研究表明，在甘蓝型油菜中，黄籽与黑籽油菜相比，包括TT8基因的同源基因在内的大多数涉及类黄酮合成途径的基因都是下调的，表明这些基因在油菜的进化中是高度保守的。但是这些基因的功能还没被阐释清楚。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种控制甘蓝型油菜种子种皮颜色的基因、甘蓝型油菜黄籽突变体材料的获取方法及其应用。本发明靶向甘蓝型油菜BnTT8基因的两个同源拷贝，快速高效的获得了能稳定遗传的黄籽表型明显的甘蓝型油菜种质资源，对黄籽甘蓝型油菜的选育具有重要的意义。该突变体不含有T-DNA插入，和野生型相比，产生的种子在不影响产量相关性状的基础上含油量和蛋白质含量提高，脂肪酸组成发生改变。

本发明是这样实现的，一种控制甘蓝型油菜种子种皮颜色的基因，所述基因为BnTT8基因，其核苷酸序列为BnA09.TT8见SEQ ID NO.1或BnC09.TT8b见SEQ ID NO.2。

进一步，所述核苷酸序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2编码的氨基酸序列分别见SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。

一种甘蓝型油菜黄籽突变体材料的获取方法，所述突变体材料由上述的BnTT8的两个拷贝同时发生基因编码区内的核苷酸序列突变获得。

进一步，黄籽突变体材料的获取方法包括以下步骤：

步骤1：获取如权利要求1所述的BnTT8基因片段；

步骤2：针对如权利要求1所述的BnTT8基因的核苷酸序列设计sgRNA，并构建载体；

步骤3：将步骤2中构建的载体转化至油菜株系中，获得突变体油菜株系；

步骤4：对突变体油菜株系进行检测并测序，确定株系基因型；