[发明专利]一种雌性鸡原始生殖细胞体外扩增培养体系及其应用有效

申请号：	201910915176.2	申请日：	2019-09-26
公开（公告）号：	CN112553140B	公开（公告）日：	2022-09-16
发明（设计）人：	邹娴;罗成龙;王劼;瞿浩;舒鼎铭;王艳;吕晓慧	申请（专利权）人：	广东省农业科学院动物科学研究所
主分类号：	C12N5/071	分类号：	C12N5/071;C12N15/53;C12N15/70;C12N9/02
代理公司：	广州市华学知识产权代理有限公司 44245	代理人：	苏运贞
地址：	510640 广东***	国省代码：	广东;44
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摘要：
搜索关键词：	一种雌性原始生殖细胞体外扩增培养体系及其应用
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【权利要求书】：

1.一种雌性鸡原始生殖细胞体外扩增培养体系，其特征在于组成如下：以终浓度为体积百分比52～54%的KO-DMEM为基础培养基，按比例添加如下成分：终浓度为体积百分比30%的大鼠肝细胞培养液、终浓度为体积百分比7.5%的胎牛血清、终浓度为体积百分比2.5%的鸡血清、终浓度为体积百分比1%的非必需氨基酸、终浓度为体积百分比1%的GlutaMAXTM培养基、终浓度为体积百分比1%的丙酮酸、终浓度为体积百分比1%的β-巯基乙醇、终浓度为体积百分比1%的青霉素链霉素、终浓度为体积百分比1～3%的芳香化酶培养液、终浓度为4ng/mL的rmSCF、终浓度为2.5 ng/mL的rhFGF；

所述的芳香化酶培养液的制备包括如下步骤：以性腺cDNA为模板，扩增芳香化酶基因CYP19A1，构建重组载体，转化，挑取阳性克隆提取质粒p-EGFP-CYP，在DF1细胞中转染质粒p-EGFP-CYP，筛选稳定转染了质粒p-EGFP-CYP的细胞，扩大培养，收集上清液，得到芳香化酶培养液；

所述的芳香化酶基因CYP19A1的序列如ENSGALG00000013294所示。

2.根据权利要求1所述的雌性鸡原始生殖细胞体外扩增培养体系，其特征在于组成如下：以终浓度为体积百分比52%的KO-DMEM为基础培养基，按比例添加如下成分：终浓度为体积百分比30%的大鼠肝细胞培养液、终浓度为体积百分比7.5%的胎牛血清、终浓度为体积百分比2.5%的鸡血清、终浓度为体积百分比1%的非必需氨基酸、终浓度为体积百分比1%的GlutaMAXTM培养基、终浓度为体积百分比1%的丙酮酸、终浓度为体积百分比1%的β-巯基乙醇、终浓度为体积百分比1%的青霉素链霉素、终浓度为体积百分比3%的芳香化酶培养液、终浓度为4 ng/mL的rmSCF、终浓度为2.5 ng/mL的rhFGF。

3.根据权利要求1所述的雌性鸡原始生殖细胞体外扩增培养体系，其特征在于：

所述的扩增芳香化酶基因CYP19A1的引物为：上游引物5’-AGAAAACCTACTCAGA-3’，下游引物：5’-GGCTTACAATAATGGTAG-3’；

所述的构建重组载体采用的载体为p-EGFP；

所述的转化为转化大肠杆菌DH5α；

所述的DF1细胞是在37℃、5%CO₂条件下长至细胞密度为80~90%的DF1细胞；培养体系为体积比为90%的KO-DMEM和体积比为10%的胎牛血清；

所述的转染为每10⁸个DF1细胞中转染2µg质粒p-EGFP-CYP，6小时后换液；

所述的上清液为每3天收一次液，混合。

4.根据权利要求1或2所述的雌性鸡原始生殖细胞体外扩增培养体系，其特征在于：

所述的大鼠肝细胞培养液的制备包括如下步骤：复苏大鼠肝细胞，37℃、5%CO₂条件下培养9天，3天收集一次上清液，混合，即得大鼠肝细胞培养液。

5.根据权利要求4中所述的雌性鸡原始生殖细胞体外扩增培养体系，其特征在于：所述的大鼠肝细胞的培养体系为：体积比为89%的KO-DMEM、体积比为10%的胎牛血清和体积比为1%的GlutaMAXTM。

6.权利要求1～5任一项所述的雌性鸡原始生殖细胞体外扩增培养体系在规模化培养雌性鸡原始生殖细胞中的应用。

7.根据权利要求6所述的雌性鸡原始生殖细胞体外扩增培养体系在规模化培养雌性鸡原始生殖细胞中的应用，其特征在于：是将雌性鸡原始生殖细胞接种至雌性鸡原始生殖细胞体外扩增培养体系和大鼠肝细胞饲养层中，培养，获得规模化培养的雌性鸡原始生殖细胞。