[发明专利]一种雌性鸡原始生殖细胞体外扩增培养体系及其应用

说明书

本发明公开了一种雌性鸡原始生殖细胞体外扩增培养体系及其应用。本发明的培养体系组成如下：52～54％(v/v)KO‑DMEM、30％(v/v)大鼠肝细胞培养液、7.5％(v/v)胎牛血清、2.5％(v/v)鸡血清、1％(v/v)非必需氨基酸、1％(v/v)GlutaMAXTM、1％(v/v)丙酮酸、1％(v/v)β‑巯基乙醇、1％(v/v)青霉素链霉素、1～3％(v/v)芳香化酶培养液、4ng/mL rmSCF、2.5ng/mL rhFGF。本发明的培养体系扩增雌性鸡原始生殖细胞成功率最高可达37.5％，且能保持雌性鸡原始生殖细胞的未分化状态和良好生物学特性。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及以一种雌性鸡原始生殖细胞体外扩增培养体系及其应用。

背景技术

家禽资源保护主要以活体保种为主，但活体保种的饲养、场地、人工等成本高昂，且保种群体大多是暂时不可利用群体，因此，需要开发其它保种技术。原始生殖细胞(Primordial germ cell，PGCs)起源于上胚层，是最终形成雄性或者雌性生殖细胞的早期细胞，可以把基因从上一代传递到下一代。原始生殖细胞的分离、培养和保存有望实现家禽资源离体保种的功能，而且若能将原始生殖细胞进行基因操作，移植生成的精子或卵子将可用于生产转基因或基因编辑动物。目前，鸡原始生殖细胞的体外培养体系主要成分为：KO-DMEM、胎牛血清(FBS)、鸡血清、非必需氨基酸、GlutaMAXTM、丙酮酸、β-巯基乙醇、重组人碱性成纤维细胞生长因子(rhFGF)、人白血病抑制因子(human LIF)或人干细胞因子(humanSCF)。利用这些体系，分离培养雄性鸡原始生殖细胞的成功率超过50％，但分离培养雌性鸡原始生殖细胞的成功率只有3％左右，甚至更低。因此，该类体外培养体系比较适用于雄性鸡原始生殖细胞，不适用于雌性鸡原始生殖细胞。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种雌性鸡原始生殖细胞体外扩增培养体系。

本发明的另一目的在于提供上述雌性鸡原始生殖细胞体外扩增培养体系的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种雌性鸡原始生殖细胞体外扩增培养体系，组成如下：以终浓度为体积百分比52～54％的KO-DMEM为基础培养基，按比例添加如下成分：终浓度为体积百分比30％的大鼠肝细胞培养液、终浓度为体积百分比7.5％的胎牛血清(FBS)、终浓度为体积百分比2.5％的鸡血清、终浓度为体积百分比1％的非必需氨基酸、终浓度为体积百分比1％的GlutaMAXTM培养基、终浓度为体积百分比1％的丙酮酸、终浓度为体积百分比1％的β-巯基乙醇、终浓度为体积百分比1％的青霉素链霉素、终浓度为体积百分比1～3％的芳香化酶培养液、终浓度为4ng/mL的重组小鼠干细胞因子(rmSCF)、终浓度为2.5ng/mL的重组人碱性成纤维细胞生长因子(rhFGF)。

优选地，所述的雌性鸡原始生殖细胞体外扩增培养体系组成如下：以终浓度为体积百分比52％的KO-DMEM为基础培养基，按比例添加如下成分：终浓度为体积百分比30％的大鼠肝细胞培养液、终浓度为体积百分比7.5％的胎牛血清、终浓度为体积百分比2.5％的鸡血清、终浓度为体积百分比1％的非必需氨基酸、终浓度为体积百分比1％的GlutaMAXTM培养基、终浓度为体积百分比1％的丙酮酸、终浓度为体积百分比1％的β-巯基乙醇、终浓度为体积百分比1％的青霉素链霉素、终浓度为体积百分比3％的芳香化酶培养液、终浓度为4ng/mL的rmSCF、终浓度为2.5ng/mL的rhFGF。

所述的芳香化酶培养液的制备优选包括如下步骤：以性腺cDNA为模板，扩增芳香化酶基因CYP19A1，构建重组载体，转化，挑取阳性克隆提取质粒p-EGFP-CYP，在DF1细胞中转染质粒p-EGFP-CYP，筛选稳定转染了质粒p-EGFP-CYP的细胞，扩大培养，收集上清液，得到芳香化酶培养液。

所述的扩增芳香化酶基因CYP19A1的引物为：上游引物5’-AGAAAACCTACTCAGA-3’，下游引物5’-GGCTTACAATAATGGTAG-3’。