[发明专利]从噬菌体抗体库中筛选和验证抗狂犬病病毒中和抗体的方法及筛选试剂盒

权利要求书

1.一种从噬菌体抗体库中筛选和验证抗狂犬病病毒中和抗体的方法，其特征在于，包括如下步骤：

A、单克隆噬菌体抗体培养，并取培养上清液；

B、定性分析：RFFIT法初步筛选有中和活性的抗体

将步骤A中的培养上清液置于96孔板中，每孔加入14~15倍体积DMEM培养基和15~16倍体积稀释好的中和用病毒，37℃中和1h后，加入15~16倍体积、1.0×10⁶个/mL的BSR细胞悬液，5% CO₂，37 ℃培养24 h后弃去上清，PBS清洗细胞并用60~70倍体积的80%预冷丙酮固定，而后弃去丙酮，室温静置15 min，

FITC标记的抗狂犬病病毒核蛋白抗体使用PBS 200倍稀释后，加入每孔中，37 ℃孵育1h，弃去液体，使用PBS洗涤，荧光显微镜下观察和记录各孔感染比例，对病毒生长有明显抑制的孔被标记为阳性孔，

从阳性孔对应的96孔板中取菌液，加入2YT-A培养基，37℃、220rpm过夜培养后测序，选取正确的scFv序列并选取序列不重复的克隆进入步骤C；

C、定量分析：单克隆噬菌体抗体颗粒活性测定

挑选不同序列有中和活性的各个克隆，按照步骤A进行单克隆噬菌体抗体培养，并取培养上清液；在获得的上清液中加入1/5体积的20% PEG-8000 + 2.5mol/L NaCl溶液，混匀，静置冰浴中1h，10000g离心20min，沉淀即为噬菌体抗体颗粒，

将获得的噬菌体抗体颗粒15倍稀释后，分别加入96孔细胞培养板中，每孔加入同等体积中和用病毒，37 ℃中和1 h后，加入同等体积的1.0×10⁶个/mL的BSR细胞悬液，5% CO₂，37℃培养24 h后，弃去上清；PBS清洗细胞后，加入四倍体积预冷的80%丙酮，30℃固定10 min，而后弃去丙酮，室温静置15 min；FITC标记的抗狂犬病病毒核蛋白抗体使用PBS 200倍稀释后，每孔加入两倍体积，37 ℃孵育1 h后弃去液体，而后使用PBS洗涤；荧光显微镜下观察和记录各孔感染比例并按狂犬病免疫球蛋白效价测定法中公式计算抗体活性；

D、全分子抗体瞬时表达和活性分析

选择噬菌体抗体颗粒活性大于0.5IU/ml的克隆，扩增抗体可变区基因，构建真核瞬时表达质粒，瞬转HEK 293EBNA1细胞，培养上清经Mabselect SuRe亲和纯化后测定抗狂犬病病毒抗体比活，得到抗狂犬病病毒中和抗体。

2.根据权利要求1所述的从噬菌体抗体库中筛选和验证抗狂犬病病毒中和抗体的方法，其特征在于：

其中，步骤A中进行单克隆噬菌体抗体培养，并取培养上清液的具体制备方法如下：

将经过三轮筛选后的噬菌体抗体加入E.coli TG1菌液中混匀，室温静置感染30~40min；菌液涂布于2YT-A平板、30℃过夜培养后，挑取克隆至含2YT-A的96孔板中过夜培养；而后培养物在新鲜2YT-A培养基中220rpm，37℃培养1.5h，然后加入MK1307辅助噬菌体，混匀，室温静置感染30~40min，离心后重悬细胞于2YT-A/K培养基中，培养过夜后离心收集含有单克隆噬菌体抗体颗粒的上清液。

3.根据权利要求1所述的从噬菌体抗体库中筛选和验证抗狂犬病病毒中和抗体的方法，其特征在于：

其中，噬菌体抗体的测序引物序列如SEQ NO.1所示。

4.根据权利要求1所述的从噬菌体抗体库中筛选和验证抗狂犬病病毒中和抗体的方法，其特征在于：

其中，在计算抗体活性时，若某个样品中作为最高浓度孔的150倍稀释孔中被感染细胞数超过50%，则认为该样品不具有明显的抗狂犬病病毒中和活性，其噬菌体抗体活性结果被记为0IU/mL。

5.根据权利要求1所述的从噬菌体抗体库中筛选和验证抗狂犬病病毒中和抗体的方法，其特征在于：

步骤D中，构建真核瞬时表达质粒的方法如下：

比对抗体可变区序列，确定抗体亚型；分别使用对应的κ、λ轻链载体构建对应轻链表达质粒，所有序列均使用相同的重链载体构建各自的重链表达质粒；使用SEQ NO.2~7所示的瞬时表达引物从具有中和活性的噬菌体颗粒对应的克隆中扩增抗体轻、重链可变区，然后将PCR产物构建入质粒中，挑取克隆测序鉴定，选择测序结果符合预期的克隆并抽提质粒。