[发明专利]从噬菌体抗体库中筛选和验证抗狂犬病病毒中和抗体的方法及筛选试剂盒

说明书

本发明涉及生物医药工程技术领域，公开了一种从噬菌体抗体库中筛选和验证抗狂犬病病毒中和抗体的方法，包括A、单克隆噬菌体抗体培养，并取培养上清液；B、定性分析：将步骤A中的培养上清液置于96孔板中，依次经DMEM培养基以及中和用病毒中和、BSR细胞悬液培养、预冷丙酮固定后，与稀释后的FITC标记的抗狂犬病病毒核蛋白抗体共孵育，选择可明显抑制病毒感染的克隆测序，排除重复的序列，初步获得中和活性各不相同的抗狂犬病病毒抗体序列；C、定量分析：挑选不同序列有中和活性的各个克隆，重新制备噬菌体抗体颗粒，纯化并稀释一定倍数后采用RFFIT法测定体外中和活性；以及D、全分子抗体瞬时表达和活性分析。

技术领域

本发明涉及生物医药工程技术领域，具体涉及一种从噬菌体抗体库中筛选和验证抗狂犬病病毒中和抗体的方法及抗体筛选试剂盒。

背景技术

狂犬病是一种严重的致死性疾病，人和所有温血动物均易感染。狂犬病属弹状病毒科，主要分为7个基因型。狂犬病病毒为RNA病毒，其编码核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、依赖RNA的RNA多聚酶(L)和糖蛋白(G)五种结构蛋白，其中糖蛋白(Glycoprotein，G)为跨膜蛋白，构成病毒表面的突起，是主要保护性抗原，可以诱导保护性抗体产生。糖蛋白主要由3个主要抗原表位及其他次要表位组成，表位I位于AA226-331，是一个线性表位；表位II是由AA34-42和AA198-200组成的一个构象表位；表位III是由AA330-338构成的构象表位；G5表位是一个线性表位，由AA261-264组成；G1表位由AA341-343构成。

狂犬病目前仍然缺乏有效的治疗手段，一旦发病几乎100％死亡，对狂犬病的预防主要使用狂犬病病毒疫苗进行，由于疫苗接种到产生抗体需要一定时间，因此，对于III级以上暴露必须同时使用抗狂犬病病毒免疫球蛋白。目前市场上的抗狂犬病病毒免疫球蛋白均存在一定问题或限制，如由于血源来源问题而无法大量生产、潜在的疾病传播风险或血清病等。抗狂犬病病毒单克隆抗体克服了上述产品的缺点，是非常有希望的升级替换产品。噬菌体抗体库技术是获得抗体序列的主要技术之一，广泛应用于抗体的筛选。

噬菌体抗体库的初步筛选通常使用ELISA法进行，首先筛选与抗原结合的阳性克隆并对阳性克隆测序分析，然后构建原核表达质粒，大肠杆菌表达scFv后进行活性验证，最后构建全分子抗体进行性质分析，该种筛选方法缺点明显如下：

首先，该方法只能评价抗体与抗原的结合活性而无法评价抗体的中和活性，因此阳性克隆中中和抗体所占比例较低，大部分为不具备中和活性。如de KruifJ等使用灭活病毒或重组糖蛋白从人特免库中筛选获得147个序列中，仅39个有活性，其中21个构建为ScFv表达，14个活性大于500IU/mg(de Kruif J,Bakker A B,Marissen W E,et al.A humanmonoclonal antibody cocktail as a novel component of rabies postexposureprophylaxis[J].Annu Rev Med,2007,58:359-368.)，考虑到抗体scFv形式的比活通常高于其全分子形式，因此14个抗体只有部分表达为全分子抗体后活性可以达到500IU/mg。SunL等在另一个实验中，使用aG株病毒为抗原对1000个克隆进行ELISA分析，其中260个克隆为阳性，免疫荧光分析表明其中70个与表达aG株糖蛋白的293T细胞结合，序列分析表明其中11个为独特序列，RFFTI分析确定其中5个具有中和活性，3个体外抗狂犬病病毒中和活性大于500IU/mg(Sun L,Chen Z,Yu L,et al.Generation and characterization ofneutralizing human recombinant antibodies against antigenic site II of rabiesvirus glycoprotein[J].Appl Microbiol Biotechnol,2012,96(2):357-366)。