[发明专利]糖基转移酶突变体及其应用

说明书

本发明涉及糖基转移酶突变体及其应用。揭示了一种突变型糖基转移酶UGT76G1，所述的突变型糖基转移酶UGT76G1的催化活性、底物专一性和/或底物特异性发生变化，在特定位点的突变可显著地促进含有1,2‑二葡萄糖基(槐糖基)的底物进行1,3‑糖基化的催化活性，显著地减弱其在葡萄糖单糖基底物基础上进行1,3‑糖基化的催化活性。同时，本发明也揭示了一系列弱化糖基转移酶UGT76G1的催化活性的突变体，能够增加特定甜菊糖苷中间体的积累。

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种糖基转移酶突变体及其应用。

背景技术

糖基化是天然产物合成中最广泛的修饰之一。在植物体内，糖基化修饰改变天然产物的溶解性，稳定性，毒性以及生理活性，具有代谢物脱毒，防止生物侵害，改变物质的分配区间等功能。许多植物来源天然产物的糖基化由UDP依赖型糖基转移酶(UGT)催化，UGT利用UDP活化的糖作为糖基供体，将糖分子特异地转移到受体分子的糖基化位点上。目前，已发现或者被注释的植物来源的UGT多于2300个，然而蛋白结构被解析的UGT仅有约20个。

甜菊糖苷类化合物是一类高度糖基化修饰的二萜天然产物，主要来自于菊科植物甜叶菊。甜菊糖苷类化合物具有高甜度、低热量的特点，能够取代蔗糖以及其他人工合成甜味剂，在食品工业中具有巨大的经济效益。目前广泛应用的甜菊糖类主要包括天然来源的莱宝迪苷A(Rebaudioside A)和甜菊苷(Stevioside)，虽然该类产品甜度达到蔗糖的300～600倍，仍然存在苦涩后味等不利缺点，口感有待改进。近年来针对甜菊糖的产业升级主要集中在将莱宝迪苷A和甜菊苷升级为口感更佳，甜度更高的莱宝迪苷D和莱宝迪苷M。

莱宝迪苷D和莱宝迪苷M在原植物中含量非常低，通过植物提取纯化的方式成本巨大，目前的产量远远不能够满足市场需求。莱宝迪苷D和莱宝迪苷M是苷元甜菊醇(steviol)分别经过5步或6步糖基化修饰形成的多糖苷，它们合成途径中的中间体包括莱宝迪苷A和甜菊苷。根据报道，UGT76G1负责催化甜菊苷生成莱宝迪苷A。莱宝迪苷A经UGT91D2(或EUGT11)催化生成莱宝迪苷D，或者经UGT76G1产生副产物莱宝迪苷I。莱宝迪苷D则进一步经UGT76G1催化产生莱宝迪苷M。因此，UGT76G1和UGT91D2是莱宝迪苷D和莱宝迪苷M合成中反复糖基化过程中所需要的两个关键酶基因。

由于糖基转移酶UGT76G1参与甜菊糖苷类合成中的多步糖基化反应，存在底物特异性不专一以及催化活性较弱等问题。现阶段本领域急需探索提高UGT76G1的底物专一性和催化活性的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种糖基转移酶突变体及其应用。

在本发明的第一方面，提供糖基转移酶UGT76G1突变体，所述突变体相对于野生型的糖基转移酶UGT76G1，其空间结构中与糖基供体或糖基受体相互作用的氨基酸发生突变，其催化活性改变。

在一个优选例中，所述的催化底物莱宝迪苷D生成莱宝迪苷M的活性提高为具有统计学意义的提高，如提高20％以上、40％以上、60％以上、70％以上或更高。

在另一优选例中，所述的催化莱宝迪苷A生成副产物莱宝迪苷I的活性减弱为具有统计学意义的减弱，如减弱20％以上、40％以上、50％以上或更弱。

在另一优选例中，所述的糖基转移酶UGT76G1突变体中是：

(a)氨基酸序列对应于SEQ ID NO:1，第284、147、155、146、380、85、87、88、90、91、126、196、199、200、203、204或379位发生突变的蛋白；