[发明专利]基于TdT酶和NtbspQI切刻酶联用检测脑胶质瘤标志物的方法在审
| 申请号： | 201910918646.0 | 申请日： | 2019-09-26 |
| 公开（公告）号： | CN110878335A | 公开（公告）日： | 2020-03-13 |
| 发明（设计）人： | 常津;崔警予;宫晓群;朴佳芳 | 申请（专利权）人： | 天津大学 |
| 主分类号： | C12Q1/682 | 分类号： | C12Q1/682 |
| 代理公司： | 天津市北洋有限责任专利代理事务所 12201 | 代理人： | 程小艳 |
| 地址： | 300072*** | 国省代码： | 天津;12 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 基于 tdt ntbspqi 切刻酶 联用 检测 胶质 标志 方法 | ||
1.基于TdT酶和NtbspQI切刻酶联用检测脑胶质瘤标志物的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)茎环结构和DNA探针与miRNA-153充分结合，发成构象变化，提供出NtbspQI切刻酶切割位点；(2)同时加入NtbspQI切刻酶和TdT，进行切割和延伸；(3)生成的polyT中加入铜离子，再加入还原剂，通过铜和polyT结合后给予335nm的激发光，可以给出565nm的发射光。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，用于检测微小RNA的是由TdT和NtbspQI切刻酶联用。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，用于检测微小RNA的由TdT和NtbspQI切刻酶联用时，只可使用TdT所携带的buffer，NtbspQI切刻酶所携带的NEBuffer.3.1的存在会影响TdT的活性，切割和延伸包括以下步骤：
配制含有250μM CoCl2(末端脱氧核苷酸转移酶试剂盒提供)、1×末端脱氧核苷酸转移酶反应缓冲液(末端脱氧核苷酸转移酶试剂盒提供)和4mM dTTP的反应体系，向体系中加入待测微小RNA、茎环结构、DNA探针和20U末端脱氧核苷酸转移酶、5UNtbspQI切刻酶，恒温37℃反应60min，85℃灭活25min。后加入铜离子(200uM)和还原剂，最后在酶标仪上检测荧光值。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，用于检测微小RNA的由TdT和NtbspQI切刻酶联用时，TDT和NtbspQI切刻酶的最适比例为5:1。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：茎环和DNA探针的设计：茎环和DNA探针都有一段和miRNA-153互补的序列，茎环和DNA探针也有一段互补的序列。
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