[发明专利]基于TdT酶和NtbspQI切刻酶联用检测脑胶质瘤标志物的方法

说明书

本发明公开一种基于末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)和NtbspQI切刻酶联用信号放大检测脑胶质瘤标志物的方法。首先，利用NtbspQI切刻酶的特定位点切割DNA和以dTTP为底物，利用TdT的无模板3端生长polyT的功能，将传统的单纯检测miRNA转化为利用铜离子检测polyT，实现了miRNA‑153的高效、快捷、灵敏度高、特异性强的检测，该方法具有良好的特异性、灵敏度以及抗干扰能力，为建立灵敏而特异的miRNA检测方法提供了新方向。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体为一种基于TdT酶和NtbspQI切刻酶联用检测脑胶质瘤标志物的方法。

背景技术

近些年来，很多微小RNA(microRNAs,miRNAs)已经成为了癌症早期诊断的潜在肿瘤标志物。已知的miRNAs中，有50％与多种人类肿瘤有关，这些miRNAs的异常表达与肿瘤的发生和发展有密切的关系。其中，脑胶质瘤(脑胶质细胞瘤)约占颅内肿瘤的46％。世界卫生组织1998年公布按死亡率顺序排位，恶性胶质瘤是34岁以下肿瘤患者的第2位死亡原因，是35～54岁患者的第3位死亡原因。致死率皆位居前列。

由于目前我国癌症患者的数量增长非常迅速，因此，对癌症的科学预防、早期诊断，及时治疗以及术后监测，已成为具有重要意义的研究课题与方向。很多生物学研究已经证实，实现对癌症的早期诊断，可以有效提高癌症的存活率，通过对miRNA的灵敏检测可以对肿瘤的发生、发展、转移以及预后起到重要的作用。本发明中示例待检miRNA为miRNA-153，它是脑胶质瘤中重要的分子生物学标志物。

传统检测方法主要包括Northern印迹法，微阵列和逆转录酶实时定量PCR(RT-PCR)。这些方法中，实时定量PCR技术相对其他两种技术来说操作简单、灵敏度和特异性较好。然而，因为miRNA有着序列短、表达量低以及稳定性相对较差的特点，所以逆转录实时定量PCR技术通常需要复杂的引物设计或引物修饰，这对于miRNA的灵敏而通用的检测是不利的。

在本发明中，设计了一种由末端脱氧核苷酰转移酶(TdT)和NtbspQI切刻酶联用进行信号放大的方法。该方法利用NtbspQI切刻酶在酶切位点进行切割，这样释放出3端羟基，TdT在3端以dTTP为底物进行延伸，长出的polyT又会被切刻酶切割，通过控制两种酶的比例，从而控制polyT的长度，切割下来的polyT和加入进去的铜离子通过还原剂的作用，使铜离子还原成0价铜，结合在polyT上，通过酶标仪检测荧光值，从而确定miRNA的量，达到了对痕量miRNA的定量检测。同时，该方案具有良好的特异性、灵敏度以及抗干扰能力，为其进一步应用提供了科学依据。

发明内容

我们研发了一种基于末端脱氧核苷酰转移酶(TdT)和NtbspQI切刻酶联用信号放大检测脑胶质瘤标志物miRNA-153的方法。

首先，利用NtbspQI切刻酶的特定位点切割DNA和以dTTP为底物，利用TdT的无模板3端生长polyT的功能，将传统的单纯检测miRNA转化为利用铜离子检测polyT，实现了miRNA-153的高效、快捷、灵敏度高、特异性强的检测，该方法具有良好的特异性、灵敏度以及抗干扰能力，为建立灵敏而特异的miRNA检测方法提供了新方向。

本发明的技术方案实现对miRNA-153的高效、快捷、灵敏度、特异性的检测，具体检测步骤如下：

(1)(序列一)和DNA探针(序列二)与miRNA-153结合

茎环结构以及DNA探针由100uM稀释到10uM，加入20ul体系中2ul使终浓度为1uM，控制不同的miRNA-153的加入量，常温混合反应1h，使三个结构发生构象变化。

(2)加入酶

加入TdT酶和NtbspQI切刻酶，37°反应1h后85°灭活25min。

(3)加入铜离子和还原剂