[发明专利]犬科动物骨髓间充质干细胞的培养方法

说明书

本发明涉及骨髓间充质干细胞培养技术领域，是一种犬科动物骨髓间充质干细胞的培养方法，其通过将采集到的犬骨髓血直接培养等过程获得骨髓充质干细胞。本发明对培养骨髓充质干细胞的步骤进行了简化，一方面，骨髓血细胞不需经过前处理包括过滤、离心及去除脂肪细胞，其优势在于更好地保持犬骨髓原有的微环境，免受外界干扰，使所包含的基质细胞、细胞外基质成分及所分泌的分泌因子为间充质干细胞生长提供全面的营养环境；另一方面，该方法仅需要简单的培养基选择贴壁BMSCs，不需要用流式细胞或免疫分选技术分离造血干细胞；同时采用本方法的培养的骨髓间充质干细胞传代周期短，产率高。

技术领域

本发明涉及骨髓间充质干细胞培养技术领域，是一种犬科动物骨髓间充质干细胞的培养方法。

背景技术

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell，BMSCs)是干细胞家族的重要成员，具有高度的增殖能力和多向分化潜能，在合适的诱导条件下能定向分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞及神经细胞等多种细胞及组织。同时，BMSCs具有获取途径简单、易培养、低免疫原性、易于外源基因转染并长期表达等特点，广泛应用于基础研究(如骨关节炎、软骨、关节、韧带、神经损伤等)、临床组织器官修复(如肝脏、肾脏、骨损伤等)和多种疾病基因治疗等领域。

犬科动物有300多种疾病如骨关节炎、肿瘤、心脏病、免疫性疾病等与人类极为相似，但犬科动物BMSCs库的研究相对滞后，目前市场仍然缺乏犬科动物BMSCs库，其中大多数传统方法步骤多、程序复杂，骨髓需要通过离心、胰蛋白酶消化组织细胞等前处理步骤才能获得初选细胞(即BMSCs)，再对初选细胞进行传代培养，然而获得初选细胞的前处理操作，使BMSCs脱离了其在骨髓中原有的生长微环境，其对BMSCs细胞生长和增殖分化均产生不利影响，导致初选细胞在后续传代培养过程中，传代周期较长。

发明内容

本发明提供了一种犬科动物骨髓间充质干细胞的培养方法，克服了上述现有技术之不足，其有效解决现有传统骨髓间充质干细胞培养技术存在的工艺复杂，传代周期长、产率低的问题。该方法操作简便快捷，可快速分离犬BMSCs,BMSCs扩增速度快、并定向诱导为成骨细胞、软骨细胞及脂肪细胞，为骨关节炎、软骨、关节、韧带、神经损伤等疾病的治疗或肝脏、肾脏、骨损伤等临床组织器官修复和多种疾病基因治疗、临床研究提供一个技术平台。

本发明的技术方案是通过以下措施来实现的：一种犬科动物骨髓间充质干细胞的培养方法，按下述步骤进行：第一步，培养：将离体的犬科动物骨髓加入含有α-MEM完全培养基的培养皿中混合均匀，每10mlα-MEM完全培养基加入2.0ml至3.0ml的犬科动物骨髓，然后在含有5％CO₂的气体环境中培养3天至5天后，得到以骨髓间充质干细胞为主的贴壁细胞群；第二步，消化、离心：将以骨髓间充质干细胞为主的贴壁细胞群依序进行磷酸缓冲盐溶液清洗、胰酶消化、α-MEM完全培养基中和以及室温离心后得到骨髓间充质干细胞。

下面是对上述发明技术方案的进一步优化或/和改进：

上述第二步得到的骨髓间充质干细胞在α-MEM完全培养基中进行传代培养，每4天至6天按照1:3比例传代一次。

上述α-MEM完全培养基是由15％胎牛血清、1％双抗以及余量的α-MEM培养基配制而成。

上述第二步中，PBS(磷酸缓冲盐溶液)、0.25％的胰酶、α-MEM完全培养基的三者使用量均按照2.0ml至3.0ml犬科动物骨髓血，采用10ml磷酸缓冲盐溶液洗2次，2ml 0.25％的胰酶消化、消化温度为37℃、消化时间为1.5至2min，6mlα-MEM完全培养基中和。

上述第二步中，每1000g第一步得到的培养物离心10min。