[发明专利]一种高产L-赖氨酸枯草芽孢杆工程菌的构建方法及应用

权利要求书

1.一种高产L-赖氨酸枯草芽孢杆工程菌，其特征在于所述基因工程菌为不带质粒抗性标记的高产L-赖氨酸枯草芽孢杆菌株CMCC（B）63501/pK18mobsacB-ΔALA ::CFLR。

2.权利要求1所述的高产L-赖氨酸枯草芽孢杆工程菌的构建方法，其特征在于按如下的步骤进行：

（1）辣椒高赖氨酸基因（CFLR）的克隆以及穿梭表达载体pHT43的构建

按照GenBank中辣椒高赖氨酸基因CFLR cDNA序列设计引物，用Trizol提取辣椒花药中的RNA，并利用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，以该cDNA为模板，应用PCR克隆CFLRCDS序列；所述CFLRCDS序列如SEQ ID NO:1所示；

（2） 含高L-氨基酸目的基因CFLR的可活动性质粒pK18mobsacB-ΔALA::CFLR的构建：

通过PCR克隆枯草芽孢杆菌基因ALA的左右边界序列alaT-L和alaT-R，并进一步得到alaT片段，之后用T4连接酶构建双交换同源重组质粒pK18mobsacB-ΔALA；然后将含有启动子和终止子的CFLR基因表达框Pgac-CFLR-rrnBT1T2通过酶切位点Sma I插入到pK18mobsacB-ΔALA中获得目的重组质粒pK18mobsacB-ΔALA::CFLR；

（3）不带抗性标记高产L-赖氨酸枯草芽孢杆菌株的构建

将重组可活动性质粒pK18mobsacB-ΔALA::CFLR转化到枯草芽孢杆菌中实现第一轮同源交换，用氨苄霉素和和氯霉素抗性平板筛选发生第一次同源重组的菌株，再挑选氨苄霉素和和氯霉素抗性平板生长单菌落培养后，进行蔗糖敏感型第二次同源重组的菌株筛选，获得不带有抗性标记质粒的重组菌株；CMCC（B）63501/pK18mobsacB-ΔALA::CFLR。

3.采用权利要求1所述高产L-赖氨酸枯草芽孢杆工程菌进行复苏扩繁的方法：

（1）复苏种子液制备：

1）、培养基准备：葡萄糖 20 g，牛肉膏1 g，蛋白胨5 g，NaCl 5 g，H₂O 1 000 ml，pH自然，高压灭菌锅121℃灭菌20 min；

2）、摇瓶培养基分装于250ml三角瓶，每瓶50ml；

从斜面上挑取一环菌种，接入摇瓶种子培养基，37℃，180rpm振荡培养12小时即为种子液；

3）、取种子液分别1ml放入1.5mlEP（20个）离心管中3000rpm，8min，4℃离心，弃上清，将菌株放入-20℃冰箱冷藏保存备用；

（2）菌株扩繁培养

1）培养基制备：葡萄糖 20 g，牛肉膏1 g，蛋白胨5 g，NaCl 5 g，H2O 1 000 ml，pH7.0，高压灭菌锅121℃灭菌20 min；

2）接种，可以采用火焰接种法，在接种口放置酒精圈，点燃后，将菌种通过火焰圈迅速倒入摇瓶内，进行计时培养；

1L培养基放入3-5L的药瓶中；

3）菌株繁殖培养：种子培养好后，将种子接到发酵罐中，接种量5%，36℃—37℃控温通风培养，转速200转/分，培养12-16h；

4）将菌液放入离心管中4℃离心，弃上清，保留沉淀；

（3）菌粉制备

1）向菌渣中加入生理盐水和保护剂，得到混合菌液；混合菌液中加入总质量的80wt%的保护液，其余为菌渣和生理盐水

2）保护剂：总质量中海藻糖10wt%，乳糖10wt%，谷氨酸钠3wt%；

3）保护液：总质量中甘油2wt%、麦芽糖1wt%、L-半胱氨酸2wt%、乳糖2wt%；

4）充分混匀后，先放入-40-80℃中预冻48-96h，然后-冷冻干燥48-72h；

最后制备完成冻干粉。

4.权利要求1所述高产L-赖氨酸枯草芽孢杆工程菌在益生菌中高效表达方面的应用；所述的益生菌中高效表达指的是重组菌株L-赖氨酸含量比野生菌株显著提高。