[发明专利]一种高产L-赖氨酸枯草芽孢杆工程菌的构建方法及应用

说明书

本发明公开了一种高产L‑赖氨酸枯草芽孢杆工程菌的构建方法及应用。根据GenBank辣椒CDS序列设计引物，以辣椒cDNA为模板，PCR克隆辣椒高赖氨酸基因CFLR，并将其插入穿梭表达载体pHT43，构建质粒pHT43‑CFLR。然后将含有启动子和终止子表达框Pgac‑CFLR‑rrnBT1T2插入到新构建的pK18mobsacB‑ΔALA中获得目的重组质粒pK18mobsacB‑ΔALA::CFLR。再将重组性质粒pK18mobsacB‑ΔALA::CFLR转化到枯草芽孢杆菌中,经过细胞内同源交换和培养基筛选，获得不带质粒抗性标记的高产L‑赖氨酸枯草芽孢杆菌株CMCC（B）63501/pK18mobsacB‑ΔALA::CFLR。结果表明，重组菌株L‑赖氨酸含量比野生菌株提高了34.89%，具有良好的应用潜力。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体说涉及一种高产L-赖氨酸枯草芽孢杆工程菌及构建方法。

背景技术

L-赖氨酸为人和动物所必需的、但自身不能合成的八种必需氨基酸之一，广泛运用于食品强化剂、医药产品和饲料添加剂等方面，其中90%以上的L-赖氨酸用作饲料添加剂。L-赖氨酸对平衡氨基酸组成、提高机体对谷类蛋白质的吸收、调节体内代谢平衡、改善动物营养及促进机体生长发育均有重要作用。目前，我国己成为世界第二大饲料生产国，对L-赖氨酸等添加剂需求量在逐年增加。另外，氨基酸饮料的开发及饮用流行和多种氨基酸保健品在市场崭露头角，都刺激着L-赖氨酸生产。因此，选育出高产L-赖氨酸菌株，提高L-赖氨酸糖酸转化率和降低生产成本具有非常重要的意义和应用前景。

目前，工业上用于生产L-赖氨酸的菌株大多数是通过物理诱变或化学诱变获得的营养缺陷型或解除调控作用的突变株。然而，与野生型菌株相比较，这些菌株存在很大的缺陷，如生长速度缓慢、糖耗速率低、对外界不良环境耐受力差等。随着生物技术的发展及枯草芽孢杆菌基因组的解析，传统诱变育种获得L-赖氨酸高产菌方法逐渐被代谢工程育种方法所取代。同时，大量研究表明，通过基因工程技术获得的基因工程菌，除保留了野生型菌株的一些优点外，还能很大程度上提高L-赖氨酸产量。因此利用代谢工程方法选育L-赖氨酸高产菌是本课题研究的主要方向。此外，由于我国用于生产L-赖氨酸菌株大多为大肠杆菌基因工程菌株，由于带有抗生素标记，菌体培养过程中需添加抗生素来维持菌体产酸的稳定性。并且，生产菌株为大肠杆菌，而2013年饲料添加剂目录明文规定饲料L-赖氨酸（纯度为65%和70%，含有大量的菌体）中不得含有大肠杆菌，因此应用大肠杆菌基因工程菌株存在巨大安全隐患，也导致在国内、国际市场上缺乏竞争力，从而制约了生产规模的扩大。枯草芽孢杆菌是食品安全性菌株，被广泛运用于氨基酸如L-赖氨酸和L-谷氨酸的生产。因此，本课题着眼于通过代谢工程育种方法对枯草芽孢杆菌代谢途径进行遗传改造，替代大肠杆菌作为L-赖氨酸生产菌，同时寻找一个合适的方法使得外源基因稳定插入到枯草芽孢杆菌基因组中，从而在发酵过程不添加抗生素，实现利用基因工程菌发酵生产L-赖氨酸。

本项课题目标是通过利用代谢工程育种方法选育高产L-赖氨酸枯草芽孢杆菌菌株，获得拥有自主知识产权的L-赖氨酸高产菌和发酵工艺优化，实现枯草芽孢杆菌菌株中L-赖氨酸增产30%以上。

发明内容

本发明的一个目的是克服现有技术的不足，提供一种产量大，低成本的L-赖氨酸枯草芽孢杆工程菌。

本发明的第二个目的是提供一种产L-赖氨酸枯草芽孢杆工程菌的构建方法。

本发明的第三个目的是提供一种将外源基因稳定插入到枯草芽孢杆菌基因组中，从而在发酵过程不添加抗生素，实现利用基因工程菌发酵生产L-赖氨酸。

为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容：

一种高产L-赖氨酸枯草芽孢杆工程菌，其特征在于所述基因工程菌为不带质粒抗性标记的高产L-赖氨酸枯草芽孢杆菌株CMCC（B）63501/pK18mobsacB-ΔALA ::CFLR。