[发明专利]利用具有荧光性能的共价有机纳米球检测酪氨酸酶的方法

说明书

本发明公开了一种利用具有荧光性能的共价有机纳米球检测酪氨酸酶的方法，是将具有荧光性能的共价有机纳米球与酪氨酸在缓冲溶液中涡旋混匀，加入一系列不同浓度的酪氨酸酶溶液，在室温~40℃下孵育0.5~1.5 h；在激发波长为432 nm，发射波长为580 nm下进行荧光测量；根据不同浓度的酪氨酸酶溶液猝灭共价有机纳米球的荧光程度不同，构建体系在580 nm处的荧光强度与酪氨酸酶溶液之间的线性关系，即可定量检测酪氨酸酶浓度。本发明建立的荧光分析法能快速、高灵敏、高选择性地实现酪氨酸酶检测；本发明整个实验过程操作非常简单，无需任何修饰和标记，成本低，应用性强。

技术领域

本发明涉及一种酪氨酸酶活性的荧光检测方法，尤其涉及一种利用具有荧光性能的共价有机纳米球检测酪氨酸酶活性的方法，属于荧光生物传感技术领域。

背景技术

酪氨酸酶是一种含铜酶，作为一种重要的氧化还原酶，其广泛存在于微生物、动植物及人体中，是黑色素代谢和儿茶酚胺的关键酶。医学研究表明，酪氨酸酶的缺失或者过表达，均会影响黑色素的产生，从而导致患皮肤癌、白癜风、白化病、黑色素瘤等疾病的风险增加。目前，酪氨酸酶已经被作为黑色素瘤的标志物之一。因此，开发有效的TYR活性检测方法对于更好地理解酪氨酸酶的生理功能，提升酪氨酸酶相关疾病的早期诊断能力具有至关重要的意义。

目前酪氨酸酶的检测方法主要有电化学法、比色法、荧光法、离子敏感场效应晶体管器件、放射法等，其中荧光光谱法以其成本低廉、操作简单、响应速度快、灵敏度高等优势，成为目前最理想、最有前景的检测手段。尽管已有一些基于碳点、有机小分子、半导体量子点和贵金属纳米簇测定酪氨酸酶活性的荧光分析法被报道。然而，它们各自也存在一些不可避免的缺陷，比如合成周期较长、光稳定性差、分离纯化过程复杂、材料重现性差等。因此，仍需要制备具有理想分析性能的新型荧光纳米材料来构建荧光传感器用于酪氨酸酶的检测。

发光共价有机聚合物材料主要由轻元素（C、O、N、B等）通过共价键结合而成，目前已经引起了科研工作者的广泛关注。据文献调研，目前对发光共价有机聚合物的研究主要集中在合成策略的探索、简单金属离子和有机小分子的检测等方面，还没有关于酪氨酸酶分析的研究报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用具有荧光性能的共价有机纳米球检测酪氨酸酶活性的方法。

一、具有荧光性能的共价有机纳米球的制备

将三（4-氨基苯基）胺（TAPA）和三（4-氨基苯基）醛（TFPA）以等摩尔比超声分散N,N-二甲基甲酰胺中形成均相溶液；再加入甲醇做反应溶剂，乙酸做催化剂，在室温~70℃下反应0.5~5.0 h；反应结束后经离心、洗涤、干燥，即得共价有机纳米球。其中催化剂乙酸的用量为原料有机醛和有机胺总摩尔量的3.0~6.0倍。

图1为本发明得到的具有荧光性能的共价有机纳米球的XPS图。从图1中可以看出，该材料主要由C、N、O三种元素组成。

图2为具有荧光性能的共价有机纳米球的拉曼光谱图。从拉曼光谱图中可以看出，该材料在1590 cm^-1（G 带）和1340 cm^-1（D带）处的拉曼峰分别对应于石墨晶格的振动和材料的无序结构。

图3为具有荧光性能的共价有机纳米球的荧光发射光谱图。从图3可以看出，共价有机纳米球的最佳激发波长为432 nm，最佳发射波长为580 nm，具有很好的发光性能。

二、酪氨酸酶活性检测

将上述制备的具有荧光性能的共价有机纳米球与酪氨酸在缓冲溶液中涡旋混匀，加入一系列不同浓度的酪氨酸酶溶液，在室温~40℃下孵育0.5~1.5 h；在激发波长为432nm，发射波长为580 nm下进行荧光测量；根据不同浓度的酪氨酸酶溶液猝灭共价有机纳米球的荧光程度不同，构建体系在580 nm处的荧光强度与酪氨酸酶溶液之间的线性关系，即可定量检测酪氨酸酶活性。