[发明专利]基于RPA技术快速检测瓜类褪绿黄化病毒的引物对、试剂、试剂盒及其检测方法和应用

权利要求书

1.一种用于检测瓜类褪绿黄化病毒的重组酶聚合酶扩增试剂，其特征在于，所述重组酶聚合酶扩增试剂包括引物对，所述引物对由引物RPA-CCYV-F和引物 RPA-CCYV-R组成；或，所述重组酶聚合酶扩增试剂包括引物对和荧光探针，所述引物对由引物Q-CCYV-F和引物Q-CCYV-R组成；所述荧光探针为荧光探针CCYV-P；

所述引物RPA-CCYV-F为序列如SEQ ID NO.1所示的单链DNA分子；

所述引物RPA-CCYV-R为序列如SEQ ID NO.2所示的单链DNA分子；

所述引物Q-CCYV-F为序列如SEQ ID NO.3所示的单链DNA分子；

所述引物Q-CCYV-R为序列如SEQ ID NO.4所示的单链DNA分子；所述荧光探针CCYV-P的序列如SEQ ID NO.5所示，其中探针序列的35位碱基T标记荧光基团FAM，H表示四氢呋喃连接子，39位碱基T标记荧光淬灭基团BHQ，3’末端标记有阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团。

2.如权利要求1所述的用于检测瓜类褪绿黄化病毒的重组酶聚合酶扩增试剂，其特征在于，用于检测瓜类褪绿黄化病毒的重组酶聚合酶扩增试剂还包括缓冲液、醋酸镁和无菌水。

3.一种检测瓜类褪绿黄化病毒的重组酶聚合酶扩增试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1或2所述重组酶聚合酶扩增试剂。

4.权利要求1或2所述重组酶聚合酶扩增试剂或权利要求3所述重组酶聚合酶扩增试剂盒在如下A1或A2中的应用：

(A1)检测或辅助检测瓜类褪绿黄化病毒；

(A2)制备检测或辅助检测瓜类褪绿黄化病毒的产品。

5.一种检测或辅助检测待测植物材料是否感染瓜类褪绿黄化病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：

提取待测植物材料的总RNA；

以总RNA为模板，采用权利要求1中的引物对进行重组酶聚合酶扩增，得到扩增产物；按照如下方法判断待测植物材料是否感染瓜类褪绿黄化病毒：

当引物对由引物RPA-CCYV-F和引物 RPA-CCYV-R组成时，若所述扩增产物含有346bp的DNA片段，则所述待测植物材料感染或候选感染瓜类褪绿黄化病毒；若所述扩增产物不含有346bp的DNA片段，则所述待测植物材料未感染或候选未感染瓜类褪绿黄化病毒；

当引物对由引物Q-CCYV-F和引物Q-CCYV-R组成时，此时同时加入荧光探针CCYV-P，通过检测荧光定量信号对待测植物材料中瓜类褪绿黄化病毒的含量进行检测。

6.如权利要求5所述方法，其特征在于，在进行重组酶聚合酶扩增时，所述引物对中的两条引物在反应体系中的摩尔量相同。

7.如权利要求5所述方法，其特征在于，所述重组酶聚合酶扩增的条件为40-42℃反应15-30min。

8.如权利要求5所述方法，其特征在于，所述重组酶聚合酶扩增的条件为42℃反应20min。

9.如权利要求5-8任一项所述方法，其特征在于，所述待测植物材料为甜瓜材料、黄瓜材料或西瓜材料。

10.如权利要求9所述方法，其特征在于，所述待测植物材料为甜瓜叶片。