[发明专利]基于RPA技术快速检测瓜类褪绿黄化病毒的引物对、试剂、试剂盒及其检测方法和应用

说明书

本发明提供基于RPA技术快速检测瓜类褪绿黄化病毒的引物对、试剂、试剂盒及其检测方法和应用。本发明通过设计检测瓜类褪绿黄化病毒的引物对，该引物对由引物RPA‑CCYV‑F和引物RPA‑CCYV‑R组成或由引物Q‑CCYV‑F和引物Q‑CCYV‑R组成。继而成功实现基于RPA技术对瓜类褪绿黄化病毒靶标基因的扩增，本发明检测方法为基于RPA技术，可用于特异性检测瓜类褪绿黄化病毒，该方法操作简便，灵敏度高，反应条件温和，反应时间短，能满足口岸和田间检测的基本需求。

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及基于RPA技术快速检测瓜类褪绿黄化病毒的引物对、试剂、试剂盒及其检测方法和应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

瓜类褪绿黄化病毒(Cucurbit chlorotic yellows virus，CCYV)属于长线型病毒科(Closterovirida)毛形病毒属(Crinivirus)，主要通过烟粉虱以半持久性方式传播。CCYV最早于2004年被日本学者在温室的甜瓜中发现，但是其基因组结构直到2010年才被揭示。目前，该病毒在苏丹、黎巴嫩、伊朗、希腊、埃及、沙特阿拉伯等国家陆续被检测出。2011年，在中国上海市、浙江省、山东省检测到CCYV，随后河南、海南、新疆、湖南、广西等省区也陆续发现该病毒。CCYV主要侵染甜瓜、黄瓜、西瓜等作物，引起的病害症状为叶片褪绿、黄化但是叶脉仍然保持绿色，严重时整株叶片变黄，已经成为制约甜瓜作物产量和质量的重要病毒。

病毒的常规检测方法主要有生物学检测、电镜检测、血清学检测和分子生物学检测。目前，瓜类褪绿黄化病毒的检测主要是通过RT-PCR，但是该方法对仪器的依赖性太大，同时耗时长，不利于现场快速检测。

重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase polymerase amplification，RPA)近些年出现的恒温扩增技术，可在常温下完成扩增反应，与PCR相比该技术具有操作简单、耗时短、设备要求低、灵敏等优势。目前，RPA技术多应用于医学、动物上病原物的快速检测，在农业上应用于转基因的检测。近年来，瓜类褪绿黄化病毒在各地甜瓜上为害严重，并有扩大蔓延的趋势。因此，简单、快速、灵敏的检测该病毒对于该病害的防治十分重要。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明提供一种基于RPA技术快速检测瓜类褪绿黄化病毒的引物对、试剂、试剂盒及其检测方法和应用。本发明通过设计检测瓜类褪绿黄化病毒的引物对，继而成功实现基于RPA技术对瓜类褪绿黄化病毒靶标基因的扩增，灵敏度高，方法简单，可操作性强，利于在基层单位推广应用。

本发明是通过如下技术方案实现的：

本发明的第一个方面，本发明的第一个目的是提供用于检测瓜类褪绿黄化病毒的引物对。

本发明提供的用于检测瓜类褪绿黄化病毒的引物对由引物RPA-CCYV-F和引物RPA-CCYV-R组成；或，由引物Q-CCYV-F和引物Q-CCYV-R组成；

所述RPA-CCYV-F为SEQ ID NO.1所示的单链DNA分子；

所述RPA-CCYV-R为SEQ ID NO.2所示的单链DNA分子；

所述Q-CCYV-F为SEQ ID NO.3所示的单链DNA分子；

所述Q-CCYV-R为SEQ ID NO.4所示的单链DNA分子。

本发明的第二个目的是提供用于检测瓜类褪绿黄化病毒的重组酶聚合酶扩增试剂。

本发明提供的用于检测瓜类褪绿黄化病毒的重组酶聚合酶扩增试剂含有上述引物对。