[发明专利]一种基因工程菌的构建及其在高效催化5α-雄烯二酮生产中的应用

权利要求书

1.一种串联G6PDH2与5α^Y187F-还原酶的质粒，其特征在于：串联的5α^Y187F-还原酶序列如SEQ ID NO.4所示，串联的G6PDH2序列如SEQ ID NO.7所示。

2.根据权利要求1所述的串联G6PDH2与5α^Y187F-还原酶的质粒，其特征在于：将5α^Y187F-还原酶基因和表达载体连接构建携带5α^Y187F-还原酶基因的重组质粒pMV261-5α^Y187F，设计引物PCR扩增获得带有质粒pMV261核糖体结合位点的G6PDH2，将G6PDH2和重组质粒pMV261-5α^Y187F通过酶切连接，构建得到pMV261-5α^Y187F-G6PDH2重组质粒。

3.一种串联G6PDH2与5α^Y187F-还原酶的基因工程菌，其特征在于：将权利要求1或2所述的串联G6PDH2与5α^Y187F-还原酶的质粒电转至主产雄甾-4烯-3,17-二酮的分枝杆菌（Mycobacterium）中，筛选获得的阳性转化子。

4.一种串联NAD激酶与5α^Y187F-还原酶的质粒，其特征在于：串联的5α^Y187F-还原酶序列如SEQ ID NO.4所示，串联的NAD激酶序列如SEQ ID NO.8所示。

5.根据权利要求4所述的串联NAD激酶与5α^Y187F-还原酶的质粒，其特征在于：将5α^Y187F-还原酶和NAD激酶分别与表达载体pMV261酶切连接构建带有5α^Y187F-还原酶基因的重组质粒pMV261-5α^Y187F及携带NAD激酶基因的重组质粒pMV261-NAD，设计引物PCR扩增获得带有质粒pMV261核糖体结合位点的NAD2，将NAD2和重组质粒pMV261-5α^Y187F通过酶切连接，构建得到pMV261-5α^Y187F-NAD2重组质粒。

6.一种串联NAD激酶与5α^Y187F-还原酶的基因工程菌，其特征在于：将权利要求4或5所述的串联NAD激酶与5α^Y187F-还原酶的质粒电转至分枝杆菌，筛选获得的阳性转化子。

7.权利要求3或6中任一所述的基因工程菌在5α-雄烯二酮生产中的应用。

8.根据权利要求7所述的基因工程菌在5α-雄烯二酮生产中的应用，其特征在于：利用所述基因工程菌发酵制备5α-雄烯二酮，按8%体积比的接种量转接至发酵培养基中，28-32℃，130-250 r/min，pH 6.5-7.8条件下，发酵4-8 d。

9.根据权利要求8所述的基因工程菌在5α-雄烯二酮生产中的应用，其特征在于：所述发酵培养基组成为：K₂HPO₄ 0.5 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5 g/L，柠檬酸铁铵 0.05 g/L，柠檬酸2 g/L，磷酸氢二铵 3.5 g/L，葡萄糖10 g/L，植物甾醇1-30 g/L，其余为水，pH为6.5-7.8。