[发明专利]一种基因工程菌的构建及其在高效催化5α-雄烯二酮生产中的应用

说明书

本发明提供一种辅酶再生体系，具体为串联葡萄糖‑6‑磷酸‑脱氢酶(G6PDH)及5α^Y187F‑还原酶重组体和串联NAD激酶及5α^Y187F‑还原酶重组体，构建其基因工程菌并应用在高效催化5α‑AD生产中的应用；将5α^Y187F‑还原酶分别与分枝杆菌来源的G6PDH和NAD激酶重组质粒电转至分枝杆菌中进行异源表达，再对其生产效率进行测定，发现串联表达的基因工程菌MNR M3/261‑5α^Y187F‑G6PDH2对5α‑AD的生产由原来的67.8％提高到了89.5％，串联表达菌株MNR M3/261‑5α^Y187F‑NAD2对5α‑AD的生产由原来的67.8％提高到了92.6％，有效解决了5α‑还原酶催化活性低的限制问题，为5α‑还原酶的分子改造提供了一条新的思路。

技术领域

本发明属于基因工程领域，尤其是涉及一种基因工程菌的构建及其在高效催化5α-雄烯二酮生产中的应用。

背景技术

5α-AD作为合成美雄诺龙、美睾酮等数十种甾体激素类药物的关键中间体，具有重要的市场价值和研究前景。目前工业上主要以雄甾-4烯-3,17-二酮（AD）经过一系列的化学反应制得，但也存在着耗时长，环境污染大等问题。生物转化的方法有着绿色、环保、高效的特点，正成为许多化学合成工艺的替代技术。

甾体5α-还原酶属于还原型辅酶II（NADPH）依赖型酶，其能够催化一系列类固醇底物在4, 5位双键发生还原作用，并将C-5位上的氢加成在α位上成为相应的5α-还原产物。例如，睾酮（TS）在5α-还原酶的作用下被还原成一种活性更强的甾体激素：双氢睾酮（DHT），其在雄激素的生理调节以及人的两性分化等方面，发挥着极其重要的作用；雄甾-4-烯-3,17二酮（AD）能够在类固醇5α-还原酶的催化作用被还原为重要的甾体药物中间体：5α-雄烯二酮（5α-AD）中间体。还原型辅酶Ⅱ（NADPH）作为微生物代谢网络中含量最丰富的氧化还原辅酶之一，参与细胞内的重要合成代谢。在微生物的催化反应中，细胞内辅酶含量也会不断消耗，随着辅酶含量的减少，催化反应便无法继续进行。近年来，人们陆续提出了一系列的方法，包括酶法、电化学、光化学等方法，以解决胞内辅酶NADPH再生，酶法再生因其选择性高、反应速率快等优势而受到广泛重视。

一些化学法和生物法可用于合成重要甾体化合物5α-AD，但化学法往往伴随着反应步骤多、环境污染大、过程不好控制等问题。生物法因其条件温和、环境友好、专一性强等优势，已越来越受关注。但现已发现的5α-还原酶，其对底物表现的活性并不能满足工业化生产的要求，在一定程度上限制了其应用。随着人们对5α-还原酶的功能和作用机理的认识的不断深入，采用基因工程技术改造酶分子以获得具有优良酶学性质的5α-还原酶，成为今后生物催化领域的另一发展趋势。采用基因工程技术改造酶分子以获得具有优良酶学性质的5α-还原酶，成为今后生物催化领域的另一发展趋势。目前关于5α-还原酶的分子改造，主要是对底物睾酮的酶活力研究，而且其催化效率并不理想；5α-还原酶是催化AD生产5α-AD的关键酶，目前针对底物AD的5α-还原酶基因的改造还没有报道。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种基因工程菌的构建及其在高效催化5α-雄烯二酮生产中的应用。

本发明采用的技术方案是：将5α^Y187F-还原酶与辅因子再生酶串联构建得到的基因工程菌，辅因子再生酶为G6PDH2或NAD激酶。

一种串联G6PDH2与5α^Y187F-还原酶的质粒，包含于辅酶再生体系中，串联的5α^Y187F-还原酶序列如SEQ ID NO.4所示，串联的G6PDH2序列如SEQ ID NO.7所示。