[发明专利]与烟草抗斑萎病位点RTSW紧密连锁的共显性标记引物、鉴别方法及其应用

权利要求书

1.与烟草抗斑萎病位点RTSW紧密连锁的共显性标记引物，其特征在于，所述引物由引物1和引物2的两条单链DNA组成；

所述引物1序列为Seq ID No.1：

RTSW_Marker3_F 5’-CCTATGAAGCAACGAAGCGATA-3’；

所述引物2序列为Seq ID No.2：

RTSW_Marker3_R 5’-GTTGACTGTTGACTGTTGATTAGAG-3’。

2.采用如权利要求1所述引物鉴别烟草抗斑萎病位点RTSW等位基因类型的方法，其特征在于，步骤如下：

(1)分别以待鉴定烟草、烟草斑萎病抗源Polalta与斑萎病感病品种K326的基因组DNA为模板，用由引物1和引物2的两条单链DNA组成的PCR引物对基因组DNA进行PCR扩增，在含RTSW基因的植株扩增得到所特有的片段大小为490bp，其序列为SEQ ID No.3；在不含RTSW基因的植株扩增得到所特有的片段大小为570bp，其序列为SEQ ID No.4；

(2)将扩增的PCR产物通过电泳检测或者测序，按照如下方法鉴别并确定待鉴定烟草抗斑萎病位点RTSW等位基因类型：

1)如果待鉴定烟草的PCR扩增产物经电泳或测序后的条带仅与Polalta的带型相同，且含有大小为490bp的条带，则待鉴定烟草为抗斑萎病烟草或候选为抗斑萎病烟草，且基因型为抗性RTSW基因位点纯合；

2)如果待鉴定烟草的PCR扩增产物经电泳或测序后的条带仅与K326的带型相同，且含有大小为570bp的条带，则待鉴定烟草为感斑萎病烟草或候选为感斑萎病烟草，且基因型为感病rtsw基因位点纯合；

3)如果待鉴定烟草的PCR扩增产物经电泳或测序后的条带同时含有与Polalta和K326带型相同的条带，且大小分别为490bp和570bp，则待鉴定烟草为抗斑萎病烟草或候选为抗斑萎病烟草，且基因型为抗病RTSW/rtsw,基因位点杂合。

3.权利要求1所述与烟草抗斑萎病位点RTSW紧密连锁的共显性标记引物在烟草斑萎病抗病基因定位、克隆或选育烟草抗斑萎病品种中的应用。

4.如权利要求2所述的采用所述引物鉴别烟草抗斑萎病位点RTSW等位基因类型的方法，其特征在于，提取待鉴定烟草DNA时，采用烟草的种子、叶片、根、花器任意一个部位或几个部位的组织。

5.如权利要求2所述的采用所述引物鉴别烟草抗斑萎病位点RTSW等位基因类型的方法，其特征在于，所述的用由引物1和引物2的两条单链DNA组成的PCR引物进行PCR扩增，PCR的反应体系如下：分别以待鉴定烟草、烟草斑萎病抗源Polalta与斑萎病感病品种K326的基因组DNA为模板，PCR扩增体系：2×Premix Ex TaqMix PCR Buffer 12.5μL，10μmol/L引物1和引物2各0.5μL，50ng/μL模板DNA 1μL，加灭菌双蒸水使总体积为25μL；PCR反应程序为：94℃预变性5min；然后进入35个循环：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s；循环结束后72℃延伸10min；4℃保存。