[发明专利]与烟草抗斑萎病位点RTSW紧密连锁的共显性标记引物、鉴别方法及其应用

说明书

与烟草抗斑萎病位点RTSW紧密连锁的共显性标记引物、鉴别方法及其应用，所述分子标记引物由引物1和引物2的两条单链DNA组成。本发明的共显性标记引物能够特异性的对烟草基因组DNA进行标记鉴定，检测烟草材料基因组DNA中RTSW的等位基因类型，不仅可以鉴定是否含有抗斑萎病位点RTSW，而且可以鉴别烟草抗斑萎病位点RTSW等位基因类型，可靠且使用方便，与以往的抗斑萎病标记相比，具有与目标基因RTSW紧密连锁、准确性高、成本低廉、检测效率高等优点，可大大提高抗烟草斑萎病基因RTSW品种的筛选效率，极大地缩短抗病烟草品种的育种周期，提高育种效率。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，特别是涉及可鉴别烟草抗斑萎病基因位点RTSW的分子标记及其在烟草RTSW抗病基因定位、克隆或选育烟草抗斑萎病品种中的应用。

背景技术

烟草斑萎病是由正番茄斑萎病毒属(Orthotospovirus)病毒的侵染所造成的烟草病害。该属病毒是寄主范围最广、发生最为严重的一类植物病毒，其美洲型代表种番茄斑萎病毒(Tomato Spotted Wilt Virus,TSWV)已对我国云南烟区的烟叶生产构成了较大的威胁。最近几年从云南各地(州、市)县采集样品检测结果看，云南全省烟草上TSWV均有分布并有扩大和加重的趋势。而更让人忧虑的是目前云南省的烤烟主栽品种均不抗TSWV，田间调查发现现有的主栽烤烟品种K326、红花大金元、云烟87等均能被TSWV侵染，成为TSWV流行、爆发的潜在因素。烟草斑萎病常用的防治手段主要依赖防治传毒介体蓟马，但由于蓟马具有发育历期短、个体小易隐蔽、对杀虫剂极易产生抗药性等的特点，所以现有的防治措施难以取得理想的控制效果，因而，选育抗斑萎病的烤烟品种是最经济、最有效的手段。

野生烟草资源含有丰富的抗性基因。研究表明花烟草(Nicotiana alata)对TSWV具有很好的抗性。接种TSWV仅在接种叶表现过敏性坏死症状，在系统叶中检测不到病毒的存在。经过一系列的常规杂交和回交转育，研究人员已将该抗性基因从花烟草抗性转育至烤烟品种中，育成抗病育种中间材料Polalta。Nicotiana alata和Polalta对TSWV的抗性是由显性的单基因(命名为RTSW)位点控制。

但令人遗憾的是，抗病基因RTSW尚未被克隆。在短时间内无法克隆抗病基因的情况下，开发和抗病基因紧密连锁的分子标记成为烟草斑萎病抗病育种的重要手段。迄今为止，国际上仅有H.Moon和J.S.Nicholson(2007)开发了相应的分子标记，但其AFLP标记存在和抗性基因遗传距离较远，连锁不紧密，开发的SCAR标记在实际应用中存在容易产生假阳性的问题。而且这两种标记都无法区分抗性位点的纯合/杂合基因型，限制了这些标记的大规模应用。在利用RTSW进行烟草抗斑萎病的育种过程中，其杂交或回交后代中会分离出该基因的不同基因型单株，这就需要对杂交或回交后代植株进行单株基因型的检测，选择出RTSW纯合或杂合的单株，用于随后进一步的回交或自交。共显性标记(codominancemarker)是能同时检测出显性和隐性等位基因、能够区分纯合和杂合基因型的遗传标记。因此，开发可用于鉴别烟草抗斑萎病位点RTSW等位基因类型的共显性标记，可以建立一种简便、快速、准确、灵敏的鉴定烟草抗斑萎病基因方法，弥补现有技术的不足。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种与烟草抗斑萎病位点RTSW紧密连锁的共显性标记引物和采用所述引物鉴别烟草抗斑萎病位点RTSW等位基因类型的方法以及所述引物在烟草斑萎病抗病基因定位、克隆或选育烟草抗斑萎病品种中的应用具体应用，该分子标记引物及鉴别方法可用于筛选含有RTSW抗病基因位点的资源和育种单株，并可以精确的获得含有RTSW抗病基因位点的纯/杂合基因型，达到简便、快速、准确、灵敏的鉴定烟草抗斑萎病基因位点方法的效果，为选育出高抗斑萎病的烟草育种材料提供技术手段。

在本发明的上下文中，术语“抗斑萎病基因位点RTSW”是指包含烟草斑萎病抗病基因(RTSW基因)野生烟染色体片段的位点。

为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：