[发明专利]一种基于GC-MS技术的高通量定量分析猪肝脏内源代谢物的方法

权利要求书

1.一种基于GC-MS技术的高通量定量分析猪肝脏内源代谢物的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、肝脏样品的前处理:将采集的肝脏样品存放于-196℃的液氮罐中猝灭30分钟，终止代谢反应，再转移到-80℃冰箱中存放，将从冰箱中取出的肝脏样品置于研钵中，加入液氮冷冻并研磨成粉末后，装入15mL离心管中再于-80℃冰箱中保存留待分析；

S2、肝脏代谢物的萃取:准确称量50mg肝脏粉末样品于2mL的离心管中，加入1mL提取液和20μL浓度1mg/mL的¹³C标记-D核糖醇作为内标物，充分混匀样品，接着使用超声仪进行冰水浴超声30分钟，而后在4℃，15000rpm条件下离心10分钟，然后吸取200μL上层清液于1.5mL离心管中，在室温下真空浓缩干燥2小时得到肝脏代谢物；所述提取液为水、正己烷和氢氧化钠溶液按体积比(2-4)：(3-5)：(1-3)进行均匀混合制成，且氢氧化钠溶液的浓度为2mol/L；再通过甲醇水混合液二次萃取，4℃，400rpm条件下振摇10分钟，所述甲醇水混合液中甲醇和水的体积比为1:1，而后在4℃，15000rpm条件下离心10分钟；

S3、代谢物的衍生化处理：往真空浓缩干燥后的样品中加入50μL浓度20mg/mL的甲氧基胺盐酸盐吡啶溶液，充分混匀后置于振摇仪上振摇2小时，后再加入100μL硅烷化试剂N-甲基-N三甲基硅烷三氟乙酰胺，充分混匀60秒后置于振摇仪上振摇30分钟，反应后进行离心，并取适量上层清液转移到带有150μL内插管的进样瓶内待用；

S4、GC-MS检测：样品采用气相色谱质谱联用仪进行检测，其中色谱条件为：HP-5MS毛细管色谱柱，所述色谱柱规格为30m x 0.25mm,0.25μm，升温程序为85℃恒温5分钟，而后以8℃/分钟升温到195℃，保持7分钟，再以10℃/分钟升温到205℃，持续10分钟，最后以10℃/分钟升温到300℃，持续10分钟；质谱条件为：离子传输线温度为280℃，离子源温度为230℃，四级杆温度为150℃，EM电压为1070V，质量扫描范围为m/z 50-1000；选择“全扫描模式”和“选择离子监测模式”分别进行扫描，先将全扫描方式采集的数据进行代谢物的定性分析，准确定性了猪肝脏中的64种物质，得到64种物质的保留时间、特征离子碎片，然后根据保留时间和特征离子碎片，采用选择离子监测方式对64种物质进行准确定量分析。

2.根据权利要求1所述的一种基于GC-MS技术的高通量定量分析猪肝脏内源代谢物的方法，其特征在于：所述提取液为水、正己烷和氢氧化钠溶液按体积比2:4:1进行均匀混合制成，且氢氧化钠溶液的浓度为2mol/L。

3.根据权利要求1所述的一种基于GC-MS技术的高通量定量分析猪肝脏内源代谢物的方法，其特征在于：所述提取液为水、正己烷和氢氧化钠溶液按体积比3：5：2进行均匀混合制成，且氢氧化钠溶液的浓度为2mol/L。

4.根据权利要求1所述的一种基于GC-MS技术的高通量定量分析猪肝脏内源代谢物的方法，其特征在于：步骤S2中，样品振摇条件为：4℃，400rpm条件下振摇10分钟，过滤采用0.22μm的有机针相式滤膜过滤，甲醇水混合液中水和甲醇按体积比为1:1，离心条件为4℃，15000rpm条件下离心10分钟。

5.根据权利要求1所述的一种基于GC-MS技术的高通量定量分析猪肝脏内源代谢物的方法，其特征在于：步骤S3中，样品加入甲氧基胺盐酸盐后的振摇条件为37℃，200rpm条件下振摇肟化反应2小时，加入硅烷化试剂N-甲基-N三甲基硅烷三氟乙酰胺后的振摇条件为在37℃，200rpm条件下振摇硅烷化反应30分钟，离心条件为4℃，15000rpm条件下离心10分钟。

6.根据权利要求1所述的一种基于GC-MS技术的高通量定量分析猪肝脏内源代谢物的方法，其特征在于：步骤S4中，所述气相色谱质谱联用仪为7890A GC-5975C MSD气相色谱质谱联用仪，7693自动进样器。

7.根据权利要求1所述的一种基于GC-MS技术的高通量定量分析猪肝脏内源代谢物的方法，其特征在于：步骤S4中，气相色谱以纯度99.999％的氦气为载气，进样量为1μL，流速设置为1mL/分钟，分流比50:1，进样口温度为270℃，溶剂延迟时间为4分钟。