[发明专利]一种基于GC-MS技术的高通量定量分析猪肝脏内源代谢物的方法

说明书

本发明公开了一种基于GC‑MS技术的高通量定量分析猪肝脏内源代谢物的方法，包括样品前处理、色谱质谱分离、代谢物结果鉴定、代谢物的定量分析。本发明采用有机溶剂对猪肝脏样品进行超声辅助萃取得到全面的代谢物提取物，采用保留时间和质谱谱图库定性GC‑MS采集的所有代谢物，共鉴定了64种肝脏内源代谢物；随后采用靶标定量分析方法定量分析所鉴定的64种代谢物，该方法重复性好，稳定性高，快速可靠，为开展肝脏代谢组相关研究提供了重要的参考。

技术领域

本发明涉及化学检测技术领域，具体为一种基于GC-MS技术的高通量定量分析猪肝脏内源代谢物的方法。

背景技术

肝脏是动物体代谢的中枢性器官，对营养物质的代谢发挥重要功能。例如它对于糖代谢、脂代谢、氨基酸代谢稳态的维持起重要作用。因此，对猪肝脏内源代谢物进行系统分析可以有助于深入了解猪机体代谢流的基本情况，同时实时的揭示肝脏中的代谢物成分以后，不仅有助于对尚不明确的代谢通路开展深入的机制研究，还可以根据肝脏代谢特征有针对性地优化饲料的营养配方，提高养殖生产效益，从而推进畜牧业的发展。目前为止，针对人肝脏代谢的研究比较多，但对猪肝脏代谢的研究比较少见，仅有几篇文献报导所用的技术只能检测到少于50种物质。

代谢组学是通过对一个生物系统的细胞在给定条件下所有内源性代谢物质进行定性定量，进而对其整体及其对内在因素和外在因素变化应答的规律进行检测的科学。它是继基因组学、转录组学、以及蛋白质组学后兴起的一门新技术，亦是系统生物学的重要组成之一。代谢组学的检测方式主要有核磁共振技术，气相色谱-质谱联用技术，液相色谱-质谱联用技术等。其中气相色谱-质谱联用技术由于其稳定性和可重复性强，在营养代谢组学领域应用最为广泛，为此开发出一种基于GC-MS技术的高通量定量分析猪肝脏内源代谢物的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于GC-MS技术的高通量定量分析猪肝脏内源代谢物的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种基于GC-MS技术的高通量定量分析猪肝脏内源代谢物的方法，包括如下步骤：

S1、肝脏样品的前处理:将采集的肝脏样品存放于-196℃的液氮罐中猝灭 30分钟，终止代谢反应，再转移到-80℃冰箱中存放，将从冰箱中取出的肝脏样品置于研钵中，加入液氮冷冻并研磨成粉末后，装入15mL离心管中再于 -80℃冰箱中保存留待分析；

S2、肝脏代谢物的萃取:准确称量50mg肝脏粉末样品于2mL的离心管中，加入1mL提取液和20μL ¹³C标记-D核糖醇(1mg/mL)作为内标物，充分混匀样品，接着使用超声仪进行冰水浴超声30分钟，而后在4℃，15000rpm 条件下离心10分钟，然后吸取200μL上层清液于1.5mL离心管中，在室温下真空浓缩干燥2小时得到肝脏代谢物提取物；

S3、代谢物的衍生化处理：往真空浓缩干燥后的样品中加入50μL甲氧基胺盐酸盐(20mg/mL，吡啶溶液)，充分混匀后置于振摇仪上振摇，后再加入100μL硅烷化试剂N-甲基-N三甲基硅烷三氟乙酰胺，充分混匀60秒后置于振摇仪上振摇，反应后进行离心，并取适量上层清液转移到带有150μL 内插管的进样瓶内待用；

S4、GC-MS检测：样品采用气相色谱质谱联用仪进行检测，采用全扫描和选择离子监测分别进行扫描，先用全扫描方式采集数据进行代谢物定性分析，准确定性了猪肝脏中的64种物质，得到64种物质的保留时间、特征离子碎片，然后根据保留时间和特征离子碎片，采用选择离子监测方式对64种物质进行准确定量分析。

优选的一种实施案例，步骤S2中，所述提取液为水、正己烷和氢氧化钠溶液按体积比(2-4)：(3-5)：(1-3)进行均匀混合制成，且氢氧化钠溶液的浓度为2mol/L。

优选的一种实施案例，所述提取液为水、正己烷和氢氧化钠溶液按体积比2:4:1进行均匀混合制成，且氢氧化钠溶液的浓度为2mol/L。