[发明专利]用UHPLC-Q-Orbitrap MS分析酸枣仁和理枣仁差异性化学成分的方法

权利要求书

1.一种利用UHPLC-Q-Orbitrap MS分析酸枣仁和理枣仁差异性化学成分的方法，其特征在于：酸枣仁和理枣仁药材粉末经石油醚索氏提取脱脂，采用70%乙醇加热回流提取，过滤后得样品溶液；酸枣仁和理枣仁的样品溶液进行超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱UHPLC-Q-Orbitrap-MS进行样品中化学成分分析， 质谱数据通过CompoundDiscover软件进行峰匹配、峰对齐、滤噪、归一化处理，得到包含化合物分子量、保留时间及峰面积的Excel表；将包含化合物峰面积的数据矩阵导入Simca-p软件进行多元统计分析，结合ROC曲线，找到并鉴定出酸枣仁和理枣仁的差异性化学成分；

具体步骤如下：

（1）样品的制备：精密称取各批次酸枣仁样品粉末2 g，置索氏提取中，加石油醚加热回流，药渣挥去溶剂，转移至圆底烧瓶，加入70%乙醇加热回流2小时，过滤，药渣用70%乙醇洗涤，合并洗液与滤液，回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，转移至10 mL容量瓶中，过0.45 μm滤膜，取续滤液即得供试品溶液；分别从各样品溶液中取等量溶液，混匀，置于液相小瓶中作为质量控制QC样品；所加石油醚为60～90 ℃沸程，90 mL，浸泡8小时；

（2）液相色谱-质谱条件：

色谱条件：Thermo fisher U 3000超高效液相色谱仪，色谱柱为ACQUITY UPLC® HSST3柱，150 mm×2.1 mm，1.8 µm，流动相为乙腈A，0.1%甲酸水B,梯度洗脱程序为0～8 min，5%→17%A；8～10 min，17%A；10～11 min，17→18%A；11～12 min，18→20%A；12～22min，20→33%A；22～25min，33→100%；25～27min，100→100%A；27～30min，100→5%A；30～35min，5%→5%;

流速为0.25 mL/min；柱温为35℃；进样量为3 µL；

质谱条件：Thermo Scientific^TM Q Exactive^TM Orbitrap质谱仪，使用电喷雾电离源ESI，正、负离子切换同时扫描；

喷雾电压：+3.5 KV、-2.5 KV；鞘气流速：35 arb；辅助气流速：10 arb；毛细管温度：320℃；质谱扫描模式：全扫描模式的扫描范围100～1500 m/z，分辨率70000，源内诱导碰撞裂解电压设为0 eV；MS/MS扫描模式：采用数据依赖扫描dd-ms²，分辨率17500，采用NCE梯度能量；采用的质谱扫描模式为数据依赖扫描DDA，NCE梯度能量为15，35，50；

（3）差异性化学成分分析：检测的不同批次酸枣仁和理枣仁raw通过CompoundDiscover软件计算，得到化合物峰面积的Excel表，导入Simca-p 13.0进行PCA分析、PLS-DA分析、OPLS-DA分析和s-plot分析；结合VIP值大于1，鉴定出40个差异性化学成分；差异性化学成分的鉴定，有对照品的化合物，根据保留时间、母离子以及二级碎片信息，鉴定化合物；无对照品的化合物，首先比对化合物的母离子和二级碎片信息鉴定化合物，其次参考Compound Discover软件匹配的结果；

（4）将40个差异性化学成分进行聚类热图分析；

（5）将40个差异性化学成分进行相对定量分析；

（6）运用ROC曲线下面积AUC值验证差异性化学成分的有效性，将40个差异性化学成分进行ROC曲线分析；40个差异性化学成分的AUC值均大于0.92，作为区分酸枣仁和理枣仁的标志性差异性化学成分。