[发明专利]一种用类人体纳米微囊透皮缓释技术制备皮损修复冻干粉的方法

说明书

本发明公开了一种用类人体纳米微囊透皮缓释技术制备皮损修复冻干粉的方法，涉及化妆品技术领域。包括以下步骤：(1)干细胞的原代分离和培养；(2)干细胞因子的获取；(3)干细胞因子纳米微囊的制备；(4)干细胞因子纳米微囊的检测；(5)干细胞因子纳米微囊冻干粉的制备。类人体纳米微囊的包封可以增强干细胞因子与皮肤的粘附与吸收，加速细胞增殖和迁移，促进创面上皮化，可应用于多种组织的修复再生，尤其是皮肤的损伤修复。

技术领域

本发明涉及化妆品技术领域，特别涉及一种用类人体纳米微囊透皮缓释技术制备皮损修复冻干粉的方法。

背景技术

人的皮肤由表皮、真皮和皮下脂肪构成，包含附属器官。角质层是表皮最外层，由数层角化细胞组成，能起到保护作用，防止体液外渗和化学物质内侵。也是阻碍美容产品中大分子成分吸收的主要障碍。

研究发现干细胞生长因子如成纤维细胞生长因子(FGF)，角质细胞生长因子(KGF)，表皮生长因子(EGF)，血管内皮细胞生长因子(VEGF)等能诱导皮肤细胞包括成纤维细胞与角质细胞的增殖及皮肤附属器官的再生，具有良好的美容修复能力。但作为蛋白大分子，这些细胞因子透皮性能很差，常规涂抹无法达到有效透皮剂量，难以取得理想的皮损修复效果。且细胞因子体外稳定性差、保存条件苛刻，常温易失活，因此其临床应用受到了极大的限制。

本发明所述类人体纳米微囊是利用磷脂双分子膜包封部分水相所形成的球型载体，可以包裹蛋白类物质，比如细胞因子，增强其稳定性。因结构与人体细胞膜类似，纳米微囊可以和细胞膜融合，将内部包裹的物质送入细胞内部，提高其组织穿透性能。干细胞因子经纳米微囊包裹后，与游离状态相比，透皮吸收比例显著提高。包裹生长因子的纳米微囊应用于皮肤时，不仅可促进细胞因子穿透角质层，还可在皮肤表皮层蓄积，起到长效缓释作用，提高局部浓度，增强治疗作用。因纳米微囊变形能力欠佳，容易滞留在角质层，因此需要更进一步提高其透皮能力。透皮吸收促进剂可以弥补这个缺点，其又称为促渗剂，是能够促进细胞因子等成分更快或更多地深入甚至透过皮肤，从而发挥局部或全身治疗作用的一类物质，包括月桂氮酮、丙二醇等化学促渗剂，还有近年来研究发现的一些短肽类生物促渗剂，毒性低，生物相容性良好，效用明显，对很多活性成分包括亲水性大分子都有独特的促渗作用。

发明内容

本发明的目的在于针对上述现有技术的不足，提供一种用于皮损修复的干细胞生长因子纳米微囊冻干粉，所述纳米微囊与人体内天然微囊的大小和结构类似。生长因子被纳米微囊包裹后，透皮吸收效果和常温保存稳定性得到很大提高，还可在皮肤表皮层蓄积，起到长效缓释作用，提升局部因子浓度，增强治疗作用。本发明同时提供了所述类人体纳米微囊冻干粉的制备方法。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案:一种用类人体纳米微囊透皮缓释技术制备皮损修复冻干粉的方法，包括以下步骤:

(1)脐带干细胞的原代分离和培养:

在超净工作台内，将医院来源新鲜脐带剪成小段，洗净脐带表面残余的血液；去掉血管组织，将脐带置于含双抗的培养基中，剪成3mm³左右的组织块；将剪碎的组织转移到50mL离心管中，200～300g离心5～10min；小心弃去上层培养基，加入与组织等体积的混合消化酶，于37℃摇床中，振荡消化1.5～2h。混合消化酶含Ⅱ型胶原酶2g/L、中性蛋白酶0.8g/L、透明质酸酶0.03g/L；将消化后的组织液于300～400g离心5～10min，小心弃去上清，PBS洗1次，弃上清，沉淀用α-MEM完全培养基重悬，接种于数个75cm²培养瓶中，37℃、5％CO₂培养箱中培养，每隔3天换液，长满后正常传代扩增。

(2)干细胞因子的获取:

正常培养的脐带干细胞融合度达到80％以上时，更换新鲜的不含抗生素的无血清培养基进行培养，3～5天后，收集上清液，用超滤浓缩技术富集细胞因子，即得含有多种干细胞分泌因子的溶液。BCA法测定浓缩液的总蛋白浓度，浓度范围在0.1～1.0mg/mL。