[发明专利]一种测定磷酸甘油酸激酶活性的方法

权利要求书

1.一种测定磷酸甘油酸激酶活性的方法，其特征在于，通过以下步骤实现：

（1）第一步反应：向石英比色杯中加入1 ml 反应缓冲液，再依次加入10μL、100mM 3-磷酸甘油醛至终浓度1mM，5μL、200 mM烟酰胺腺嘌呤二核苷酸至终浓度1mM，混匀溶液后，在紫外分光光度计上340 nm吸光度读数归零，再加入1 个酶活力单位的3-磷酸甘油醛脱氢酶，持续记录A₃₄₀吸光度，A₃₄₀读数迅速上升，当A₃₄₀读数稳定时，反应达到平衡；反应在pH 6.5-pH 8.5进行, 反应温度在25℃-37℃；

（2）第二步反应：第一步反应达到平衡后，加入终浓度2 mM 二磷酸腺苷和待测生物样本，此时会发生单向反应 5：

（3）分光光度法检测：在第二步反应的同时，记录A₃₄₀变化值，在340 nm吸光度处检测；

（4）荧光法检测：

在第一步反应达到平衡后，加入二磷酸腺苷至终浓度2 mM，混匀，将混合物加至96孔微孔板中，每孔50μL，再每孔加入50μL待测生物样本，每孔加入50μL 发光溶液，然后置于多功能酶标仪检测化学发光强度，同步设置PGK酶活性标准曲线，计算样品中PGK活性；发光溶液由荧光素酶1μg/mL、荧光素1μg/mL组成；

（5）酶学活性测定：

NADH的产生速率（R_NADH）通过其摩尔吸光系数，ε=6.22×10³ L×mol^-1×cm^-1，及A₃₄₀变化值△A₃₄₀计算获得，测定磷酸甘油酸激酶的初速度，根据PGK初速度计算PGK的酶学活性：

其中V代表反应体积；△T代表反应时间；

生物样本通过分光光度法测定PGK活性，最低检测酶活性为2.5x10^-3U单位，极微量生物样本通过荧光法检测，最低检测酶活性为10^-7U单位；

所述方法测定PGK催化的正向反应生物速率，测定磷酸甘油酸激酶催化 BPG 和 ADP向3-PG 和 ATP方向的反应速率。

2.根据权利要求1所述的一种测定磷酸甘油酸激酶活性的方法，其特征在于，所述生物样本是含有PGK酶的生物制品、组织液、血浆、血清、细胞裂解液、组织裂解液、细胞或组织培养液。

3.根据权利要求2所述的一种测定磷酸甘油酸激酶活性的方法，其特征在于，所述生物样本来源于动物、植物、微生物。