[发明专利]一种测定磷酸甘油酸激酶活性的方法

说明书

本发明提供一种测定磷酸甘油酸激酶活性的方法，通过测定PGK催化BPG和ADP向3‑PG和ATP正向转化的速率。本发明的正向反应更加彻底，测定的线性范围更大，反应速率更快，测定时间更短，因此相对于测定逆向反应的方法，测定正向反应可以在更加微量的样本中检测PGK的活性，具有更大的实用价值。本方法最终产生ATP，因而可以偶联荧光素酶读取ATP产生的量来测定活性，从而适应多功能酶标仪荧光检测，可以扩大样本检测通量，降低检测限。适用于检测微量样本及高通量检测。

技术领域

本发明属技术发明，涉及测定磷酸甘油酸激酶活性的方法学，尤其涉及在生物样本中测定磷酸甘油酸激酶活性的方法。

背景技术

在介绍背景技术前，先引入名词和名词缩写：PGK，Phosphoglycerate Kinase，磷酸甘油酸激酶；GAPDH，glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, 3-磷酸甘油醛脱氢酶；BPG，1,3-bisphosphoglycerate, 1,3- 二磷酸甘油酸；3-PG, 3-phosphoglycerate,3-磷酸甘油酸；GA3-P，glyceraldehyde 3-phosphate, 3-磷酸甘油醛；ADP，adenosinediphosphate, 二磷酸腺苷；ATP, adenosine triphosphate，三磷酸腺苷；Pi, phosphoricacid，磷酸；NADH，Nicotinamide adenine dinucleotide，reduced, 还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；NAD⁺，Nicotinamide adenine dinucleotide，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；Hepes：4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid，4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸；Tris，Tris(hydroxymethyl)aminomethane，三羟甲基氨基甲烷；EDTA，Ethylenediaminetetraacetic acid ，乙二胺四乙酸；SDS，Sodium dodecyl sulfate，十二烷基硫酸钠；DTT，DL-Dithiothreitol，二硫苏糖醇。

磷酸甘油酸激酶（Phosphoglycerate Kinase，PGK） (EC 2.7.2.3) 参与细胞内最重要的两条代谢途径，糖酵解和糖异生。PGK催化如下可逆的反应

1,3-二磷酸甘油酸 + ADP 3-磷酸甘油酸 + ATP………（反应 1）

在绝大多数细胞内，PGK催化的反应是正向的，有利于糖酵解过程。但在肝脏、小肠上皮、肾脏髓质，PGK催化的反应可以是反向的，有利于糖异生。在人体中，PGK存在两种亚型，PGK1和PGK2，两者催化相同的反应。PGK1广泛表达在各个器官组织中，PGK2主要在生精细胞中。

有研究指出，PGK的表达和突变与疾病有关，如肿瘤内的PGK表达增高，以维持糖酵解，对肿瘤的发展有重要意义。也有报道PGK1缺失与慢性溶血性贫血（chronic hemolyticanemia）、精神障碍（mental disorders）、肌病（myopathy in humans）有关联。

糖酵解是动物、植物、微生物必需的一条代谢通路，因此PGK在生物中广泛表达。

现有的测定PGK活性的方法是酶偶联法，其原理如下：

3-磷酸甘油酸 + ATP 1,3-二磷酸甘油酸 + ADP …………（单向反应2）

1,3-二磷酸甘油酸 + NADH NAD⁺+ 3-磷酸甘油醛………（单向反应3）

目前市场上仅有一家公司将此方法制作成测定PGK的试剂盒。

然而此方法存在显著的弱点，其报告的酶活性是到目前为止，尚无测定此反应的正向反应的酶活性方法。

发明内容