[发明专利]一株耐乙醇耐高糖的发酵菌株及构建方法

权利要求书

1.一株耐乙醇耐高糖的发酵菌株，其特征在于，所述发酵菌株为SEB12，分类命名为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，其保藏编号为CGMCC No.18216，保藏日期为2019年07月12日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

2.一种构建如权利要求1所述的耐乙醇耐高糖的发酵菌株的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

步骤1，选取出发菌株：SEB1和IR-2，将SEB1和IR-2产生的孢子通过原生质体融合获得絮凝性融合子RHZ-1；

步骤2，挑选一环RHZ-1菌株培养，再诱导其突变；

步骤3，TTC初筛和杜氏导管复筛，筛选出在乙醇和高糖条件下均产气较快的菌株进行发酵，选择产乙醇量有所提升的菌株；

步骤4，经过三轮基因组重排和步骤3的筛选方法，获得耐受性能优良的突变菌株。

3.根据权利要求2所述的构建耐乙醇耐高糖的发酵菌株的方法，其特征在于，步骤2的诱变菌株突变的方法为等离子体照射。

4.根据权利要求3所述的构建耐乙醇耐高糖的发酵菌株的方法，其特征在于，所述的等离子照射时间为50-70s。

5.根据权利要求2所述的构建耐乙醇耐高糖的发酵菌株的方法，其特征在于，步骤2的菌株培养至对数生长期与稳定期之间的过渡期。

6.根据权利要求2所述的构建耐乙醇耐高糖的发酵菌株的方法，其特征在于，步骤3的具体实验步骤包括：

a.将经过ARTP诱变后的菌液涂布于2％YPD平板上培养后，倾倒在TTC上层培养基进行染色，避光培养0.5～1h，选择红色较深的菌株保存；

b.通过杜氏导管法，取无水乙醇对应加入到内含杜氏管的YPD培养基中，混匀，接入各突变酵母静置培养，观察产气情况；

c.配制含葡萄糖的内含杜氏管的YPD培养基，接入各突变酵母，静置培养，观察产气情况；

d.选择在乙醇和高糖条件下均产气较快的菌株进行发酵，选择产乙醇量有所提升的菌株进行下一步基因组重排。

7.根据权利要求2所述的构建耐乙醇耐高糖的发酵菌株的方法，其特征在于，步骤4的具体实验步骤包括：

a.取活化后的突变菌株，接种于YPD液体培养基中，培养至对数期，离心去上清收集菌体，用无菌水洗涤后，接种于YPK预产孢培养基中，培养11-13h，离心，去上清收集菌体，无菌水洗涤后，将菌体重悬于高效液体生孢培养基中进行培养；

b.离心，去上清收集生孢后的细胞，用软化缓冲液重悬细胞使其最终浓度OD₆₀₀为5，30℃条件下培养后，离心，去上清收集菌体，用原生质体缓冲溶液重悬细胞使其最终浓度OD₆₀₀为25；

c.加入浓度为3％的蜗牛酶使其最终浓度OD₆₀₀为14.4，30℃条件下反应后，离心，去上清收集菌体，用等量的Triton X-100洗涤一次后，再用Triton X-100重悬使孢子反应液为总体积的1/4；

d.震荡该体系，使子囊壁充分破裂释放出孢子；

e.将孢子用无菌水洗涤三次后重新接入YPD液体培养基中培养至孢子进行充分接合形成二倍体菌株，将所得菌液涂布于含乙醇的YPD平板上，待菌落长起后，通过步骤3的方法进行筛选，最后通过三角瓶发酵选择性能进一步提升的突变菌株进行第二轮基因组重排，重排后的菌株再进行筛选，以此往复，通过三轮基因组重排，获得耐受性能优良的突变菌株SEB12。

8.根据权利要求7中所述的构建耐乙醇耐高糖的发酵菌株的方法，其特征在于，步骤d中的震荡方法采用的是超声波，震荡至视野中无二倍体细胞时，终止超声破碎。

9.一种如权利要求1所述的发酵菌株SEB12在非粮生物质乙醇化工业化生产的应用。