[发明专利]一株耐乙醇耐高糖的发酵菌株及构建方法

说明书

本发明提供了一株耐乙醇耐高糖的发酵菌株，所述发酵菌株为SEB12，分类命名为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，其保藏编号为CGMCC No.18216，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本发明还提供了一种上述耐乙醇耐高糖的发酵菌株的构建方法。在乙醇葡萄糖共发酵、高糖或高温情况下，本发明的发酵菌株SEB12的乙醇发酵速率相对于出发菌株较高，说明所述菌株具有耐高糖、耐高乙醇的优势，对实现非粮生物质乙醇化工业化生产具有重要意义。

技术领域

本发明涉及发酵菌株领域，具体涉及一株耐乙醇耐高糖的发酵菌株及构建方法。

背景技术

随着环境污染的加剧和全球化石能源的日渐枯竭，开发新的清洁能源势不容缓，生物乙醇作为一种新型的可再生能源，日益成为研究热点。以非粮生物质生产燃料乙醇替代化石燃料，可有效解决化石燃料带来的能源危机和环境污染，为了降低成本，则需提高终点乙醇浓度，采用超高浓度(VHG)乙醇发酵(培养基含糖量大于250g/L以期获得15％以上的乙醇)可以提高终点乙醇浓度从而提高生产设备使用率、节省精馏能耗和工业用水是一种节能减排的发酵技术。然而在VHG发酵过程中，酿酒酵母往往会受到各种因素胁迫，其中发酵初期高浓度底物的渗透作用以及终产物乙醇对菌株的毒性作用是制约酿酒酵母生产乙醇的重要瓶颈，尽管目前已有一些关于酿酒酵母对乙醇或高糖耐受能力的报道，但大多数研究以实验室酵母为出发菌株，且多针对单一物质，对多耐受性酿酒酵母的研究极少。而这些研究主要集中在酿酒酵母如何抵御乙醇毒性或高渗条件，但对于如何同时构建既耐受乙醇又耐受高糖的工业菌株尚不明确。由于在实际VHG发酵过程中，酿酒酵母会受到多种胁迫，因此，如何提高菌株在发酵初期的高糖耐受性和发酵末期的乙醇耐受性是实现非粮生物质能源转化的关键瓶颈。

选育同时具有耐受高糖和乙醇特性的工业菌株，对实现非粮生物质乙醇化工业化生产具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一株耐乙醇耐高糖的发酵菌株及构建方法，以耐高温工业菌株为出发菌株，拟通过常压室温等离子体(ARTP)技术获得耐乙醇、耐高糖突变菌株，并结合基因组重排等技术使突变菌株随机杂交，最终通过TTC显色反应、杜氏导管、摇瓶发酵等方法对突变酵母菌株进行筛选，获得一株高糖和乙醇耐受能力较强的突变菌SEB12。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面提供了一株耐乙醇耐高糖的发酵菌株，所述发酵菌株为SEB12，所述发酵菌株分类命名为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，其保藏编号为CGMCCNo.18216，保藏日期为2019年07月12日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明的第二方面提供了一种上述耐乙醇耐高糖的发酵菌株的构建方法，其包括以下步骤：

步骤1，选取出发菌株：SEB1和IR-2，将SEB1和IR-2产生的孢子通过原生质体融合获得絮凝性融合子RHZ-1；

步骤2，挑选一环RHZ-1菌株培养，再诱导其突变；

步骤3，TTC初筛和杜氏导管复筛，筛选出在乙醇和高糖条件下均产气较快的菌株进行三角瓶发酵，选择产乙醇量有所提升的菌株；

步骤4，经过三轮基因组重排和步骤3的筛选方法获得耐受性能优良的突变菌株。

进一步地，步骤2的诱变菌株突变的方法为等离子体照射。

进一步地，等离子照射时间为50-70s。

进一步地，等离子照射时间为60s。

进一步地，步骤2的菌株培养至对数生长期与稳定期之间的过渡期。

进一步地，步骤3的具体实验步骤包括：