[发明专利]一组用单管检测人运动神经元基因的引物及试剂盒

说明书

本发明公开了一组用单管检测人运动神经元基因的引物及试剂盒。本试剂盒含有一组用单管检测人运动神经元基因的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～8所示。本发明的引物设计合理、特异性高，避免普通单向单碱基错配的扩增阻滞引物特异性不足；合理地设计不同扩增子长度、引入通用引物并采用两次循环的同步扩增、减少了扩增偏倚性低，保证定量准确；合理引入识别序列，实现对SMN1和SMN2第7号外显子相互转换情况辨识，提供更多拷贝数信息；体系中引入了UDG酶、扩增程序中加入UDG酶酶切步骤能够有效切割扩增产物，避免污染。本方法和试剂盒检测快速、结果准确、成本适宜，其适用仪器在临床占有率高，非常适宜在临床中广泛应用。

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，更具体地，涉及一组用单管检测人运动神经元基因的引物及试剂盒。

背景技术

脊髓性肌萎缩症(SMA)以脊髓前角细胞(即下运动神经元)和脑干细胞核的进行性退变和丢失导致的肌无力、肌萎缩为特征的隐性遗传病。在针对SMA的多种族研究表明，SMA的总体携带率频率为1/40～1/100，发病率约为1/11000，中国人群的携带率则约为1/50。根据SMA患者的发病年龄和临床表现，SMA患者可分为4型：I型为严重型(OMIM#253300)，占SMA的60％～70％，患儿一般无法独立站立，2岁内会死于呼吸衰竭；II型为中间型(OMIM#253550)，患儿能独自站立，单不能独立行走，生存时间可超过2岁；III型为轻型(OMIM#253400)，患儿或成人可独立行走，可存活至成年；IV型为成年型(OMIM#221750)，表型较轻，成年起病，会出现四肢无力症状，但生存时间与正常人无差别。

SMA致病机制为运动神经元基因(SMN1)因缺失、转换以及点突变等原因导致SMN蛋白的功能缺陷；疾病临床表型的轻重则与SMN2基因拷贝数相关。运动神经元存活基因(SMN,NCBI#6606)位于人5号染色体的5q13位置，包括端粒侧的运动神经元存活基因1(SMN1)和着丝粒侧的运动神经元存活基因2(SMN1)。SMN1和SMN2高度同源，均含有9个外显子，仅存在5个碱基的差异。SMN1为主要功能基因，而SMN2为修饰基因。主要是因为SMN2与SMN1在第7号外显子差异，其编码序列(840C＞T)导致mRNA发生截短，编码的其蛋白功能约为SMN1的10％。根据美国ACMG在2011发布的关于《SMA检测的技术标准和指导原则》说明，95％的SMA患者为SMN1基因第7号外显子纯合缺失(包括缺失、SMN1转换为SMN2等突变类型)导致；5％为一条染色体上SMN1基因第7号外显子缺失，另一条染色体上SMN1基因发生点突变导致；其他的为复杂杂合突变导致，发生率极低。根据NCBI提供序列，SMN基因终止密码子位于第7号外显子末端。因此，SMA的诊断和携带者(“1+0”型和“2+0”型)筛查的关键在于对SMN1基因第7号外显子拷贝数的定量检测；另外SMA患者的表型分型的分子诊断则依赖于SMN2基因拷贝数的定量检测。因此，对于SMA检测诊断，确定SMN1和SMN2的第7号外显子的拷贝数情况，即能满足大多SMA患者诊断或携带者筛查的需求，经济、有效。