[发明专利]梅花参的荧光PCR检测方法及其引物和探针

说明书

本发明涉及梅花参的实时荧光PCR检测方法。基于具有高度物种特异性的梅花参线粒体细胞色素氧化酶亚基I序列(GenBank:FJ589205.1)设计了具有物种特异性的引物和探针，实现以Real‑Time PCR的方法对梅花参进行物种鉴定。本方法由于其引物和探针具有较高的特异性和灵敏度，可用于鉴别深加工后海参制品的真伪。

技术领域

本发明涉及梅花参(Thelenota ananas)的实时荧光PCR检测方法。使用TaqMan探针实时荧光PCR检测技术，对梅花参进行物种成分检测鉴定，属于生物技术领域。

背景技术

海参属于棘皮动物门(Echinodermata)海参纲(Holothuroidea)动物，全球有海参1400余种，分别属于6个目，25个科，在中国分布的有140多种。但世界上可供食用的海参约40多种，中国海域产的约有20余种。但各种海参由于营养成分的不同，和一些重要的生物学活性物质(如海参多糖、多肽、海参皂苷等等)含量的不同，价格差异巨大。梅花参属于楯手目(Aspidochirotida)、刺参科(Stichopodidae)动物，是我国产的海参中除了仿刺参以外品质较高的海参种类，主要分布在太平洋西南部，我国主要产于南海的西沙群岛，也是该海域品质最好的一种海参。梅花参体大肉厚，背部肉刺大，每3-11个肉刺的基部相连呈梅花状，故称“梅花参”。

不同海参种类间巨大的价格差异，以及干海参、盐渍海参、即食海参、冻干海参、海参胶囊及海参口服液等多种多样的销售形态，导致了市售海参中经常有鱼龙混杂、以次充好。传统的海参鉴别方法主要依赖海参的外部形态和解剖特征，如骨片特征和呼吸树的有无等等，但这往往需要鉴定人员丰富的经验。因此建立起分子鉴定方法，实现梅花参的简单、快速、准确、客观的鉴定是目前急需解决的问题。

发明内容

本发明利用实时荧光PCR技术，对梅花参进行鉴定，以满足对海参产品售假现象的监管需求。本发明提供了一种对梅花参进行定性检测鉴定的方法，可用于海参制品真伪鉴别。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

(1)样本DNA提取。取2g冷水发泡12h后的梅花参样品，在充分研磨后，使用DNA抽提试剂盒(DNeasy nericon Food Kit，QIAGEN)，按照说明书进行DNA抽提，抽提后的DNA溶解在50μL水中；

(2)实时荧光PCR扩增检测。引物探针序列如表1所示。实时荧光PCR反应体系如下：10μL Premix Ex Taq(Takara)，上游引物(10pmol/μL)0.4μL，下游引物(10pmol/μL)0.4μL，探针(10pmol/μL)0.4μL，取上述提取的DNA液2μL，用水补足体积至20μL。应用荧光定量PCR仪lightcycle480(Roche)进行反应，反应程序为(1)95℃，10sec；(2)95℃，5sec；60℃，23sec；50个循环。

(3)结果判定。Ct值小于等于43时，结果为阳性，Ct值大于43时为阴性。

表1 Real-Time PCR的引物和探针

F：上游引物；R：下游引物；P：探针.

*引用自GB/T25165-2010。该引物探针可作为内参照引物探针，检验所抽提DNA的质量。

本发明提供了一种用于检测梅花参的引物和探针，所述引物和探针序列包括：

TA-F:GCTCAACCAGGATCCCTTCT

TA-R:CCGGCTCCTCTTTCTACTCC

TA-P：FAM-CCTTCCCCCGAATGAACAAC-Eclipse。

进一步的，所述引物和探针还包括内参照引物和探针，其序列分别是：