[发明专利]一种无忧花的无菌苗诱导方法

权利要求书

1.一种无忧花无菌苗的诱导培养基，其特征在于，所述诱导培养基包括用于幼胚的诱导培养基I和用于从胚上分离的幼嫩茎段的诱导培养基Ⅱ；

所述诱导培养基I的组分含量如下：1/2MS₀ + IAA 0.5-1.0mg/L + GA₃ 0.5-3.0mg/L+水解酪蛋白500 mg/L+聚乙烯吡咯烷酮0.5-1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6.0-7.0g/L，pH5.8-6.2；

所述诱导培养基Ⅱ 的组分含量如下：MS+6-BA 0.5-3.0mg/L+NAA 0.2-1.0mg/L+水解酪蛋白 500mg/L+改性活性炭 1000mg/L+蔗糖30 g/L，琼脂粉6.0-7.0g/L，pH 5.8-6.2。

2.根据权利要求1的诱导培养基，其特征在于，所述改性活性炭的改性方法为：将核桃壳和龙眼壳按照质量比为1:2混合，进行粉碎后过100目筛，然后浸渍于1-2mol/L的盐酸溶液或1-2mol/L的磷酸溶液中1-2h，过滤后放在明火中烘烤，直至把粉末烤黑，冷却后用1-2mol/L的氢氧化钠溶液中和洗去酸液，再采用清水漂洗后干燥得到所述改性活性炭。

3.一种应用权利要求1-2任意一项诱导培养基进行无忧花无菌诱导方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

（1）果荚的采集和处理：在种子完全成熟前，6月中下旬，采摘未开裂、饱满、无病虫害的中国无忧花果荚；

（2）低温处理：将步骤（1）中获得的果荚放置于5℃冰箱内冷藏4-7d，备用；

（3）种子的消毒：剥开果荚，选取颗粒光滑、相对饱满的种子，在超净工作台上，用消毒液对种子进行消毒处理；

（4）胚的剥离：在超净工作台上，用无菌手术刀片沿着种子表面的两片子叶的连接处轻轻插入，并将种子分为两部分，选择受损伤较小、外观较为完整的胚，将暴露的胚用消毒过的镊子轻轻转入诱导培养基I中；

（5）胚的萌发：将步骤（4）中完成接种的培养基置于培养室中进行培养，前两周用黑布覆盖进行暗培养，两周后去掉黑布，可观察到胚膨大，4周后可观察到胚芽端明显伸长；培养温度为25±2 ℃，光照强度800-1500 lx，每天光照12-14 h；

（6）无菌苗的获得：接种4周后，胚芽端伸长达到1-3 cm，在超净工作台上将幼嫩的茎段从膨大的胚上分离，去除基部褐色组织，转入诱导培养基Ⅱ 中，培养4-6周后可获得长势良好的无菌苗，可用于后期的种苗扩繁和生根等操作，培养室的培养程序、温度、光照强度和光照时间与步骤（5）相同；

所述步骤（3）的消毒液对种子进行消毒处理方法为：将种子浸泡在质量百分数为0.1%的HgCl₂和0.01%的吐温-80溶液混合液中15-20min；取出后放入体积百分数为75%的乙醇溶液中浸泡30s；取出后用无菌水冲洗3-5次。