[发明专利]一种提高万古霉素产生菌生产万古霉素的方法

说明书

本发明公开了一种提高万古霉素产生菌生产万古霉素的方法，包括如下步骤：步骤一、克隆生物合成调节基因AORI_1475至载体，并转入感受态细胞培养富集；步骤二、构建包含AORI_1475基因序列的质粒，并转入大肠杆菌JM110去甲基化并过表达；步骤三、提取步骤二中所述过表达的质粒，转入万古霉素生产菌株，获得AORI_1475基因过表达的重组菌株。本发明还公开了一种生物合成调节基因AORI_1475用于生产万古霉素的应用、一种重组载体、以及一种AORI_1475基因过表达的重组菌株用于生产万古霉素的应用。采用本发明的方法，可以提高万古霉素的产量，具有良好的工业应用价值。

技术领域

本发明属于微生物基因工程技术领域，具体地说，是关于一种提高万古霉素产生菌生产万古霉素的方法。更具体而言，涉及一种生物合成调节基因AORI_1475在万古霉素产生菌中过表达提高万古霉素产量的方法。

背景技术

万古霉素在临床上常被作为治疗甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)引起感染的一线药物，通常在大多数抗菌药物治疗失败后使用，也被称作“最后一道防线”。MRSA引起皮肤脓肿和软组织感染、骨关节感染、中枢神经系统感染等，随着它对β-内酰胺类抗生素产生耐药性，万古霉素的优势也逐渐显现。万古霉素的抗菌作用主要是与细菌肽聚糖链N-酰基-D-Ala₄-D-Ala₅中的末端D,D-二肽形成氢键，从而干扰细胞壁的合成。

研究微生物次级代谢产物生物合成的调控可全面了解菌株的生理、代谢网络和调控机制，为菌株更好的发挥作用提供理论依据。strR是途径特异性转录调控基因。 1985年文献首次报导了链霉菌属strR编码的蛋白对strA和strB基因的完全表达具有正影响作用，并推测strR区可能含有参与调控链霉素合成的调节装置。2007年报道了bbr(一种strR型转录调控基因)在拟无枝酸菌Amycolatopsis balhimycina 中的转录调控，bbr编码的转录调控子与balhimycina合成基因簇中的五个启动子区域的DNA结合，对balhimycina的合成起正调控作用。Marius Spohn等将bbr引入不产抗生素的Amycolatopsis japonicum菌株，激活了氨基糖苷类抗生素ristomycin 的代谢途径。

2014年徐莉等人对东方拟无枝酸菌A.orientalis HCCB10007进行了全基因组测序，并完成基因组序列的拼接[Xu L,Huang H,Wei W等人]。东方拟无枝酸菌 HCCB10007的染色体为环形染色体，GenBank序列号为CP003410，基因组由一个环形的染色体和一个环形的内源质粒组成。HCCB10007的染色体基因具有核心区和非核心区，核心区范围是AORI_0001至AORI_2890和AORI_5565至AORI_8121。万古霉素合成基因簇(vcm)属于NRPS次级代谢生物合成基因簇，位于基因组的核心区(AORI_1471 至AORI_1505)。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种提高万古霉素产生菌生产万古霉素的方法，利用在万古霉素产生菌中过表达生物合成调节基因AORI_1475提高万古霉素的产量。本发明的第二个目的是提供一种生物合成调节基因AORI_1475用于生产万古霉素的应用。本发明的第三个目的是提供一种包含所述的生物合成调节基因AORI_1475的重组载体。本发明的第四个目的在于提供一种AORI_1475基因过表达的重组菌株用于生产万古霉素的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

作为本发明的第一个方面，一种提高万古霉素产生菌生产万古霉素的方法，包括如下步骤：

步骤一、克隆生物合成调节基因AORI_1475至载体，并转入感受态细胞培养富集；

步骤二、构建包含AORI_1475基因序列的质粒，并转入大肠杆菌JM110去甲基化并过表达；