[发明专利]一种数字PCR检测布鲁氏菌核酸DNA的方法

权利要求书

1.一种数字PCR技术检测布鲁氏菌核酸DNA的方法，其特征在于，配置PCR反应体系，经过预处理后，在一定的PCR反应条件下，使用PCR仪，进行PCR扩增，扩增结果使用微滴分析仪，进行分析判断；所述PCR反应体系，包括：待检样品核酸DNA、2╳ddPCR Supermix、引物、探针和双蒸馏水。

2.按照权利要求1所述的一种数字PCR技术检测布鲁氏菌核酸DNA的方法，其特征在于，待检测样品核酸DNA为各种可用的试剂盒提取的核酸DNA。

3.按照权利要求1所述的一种数字PCR技术检测布鲁氏菌核酸DNA的方法，其特征在于，引物和探针，根据布鲁氏菌特异编码bscp31蛋白基因的核苷酸序列，应用软件分别设计布鲁氏菌特异的引物和探针，其物核苷酸序列如下所示：

正向引物：F1：5’-ACCTTGCCCTTGCCATCAT-3’，SEQ ID NO：1；

反向引物：R1：5’-AGTCCGGCTTTACGCAGTCA-3’，SEQ ID NO：2；

探针序列：Probe：5’-TGCCGTTATAGGCCCAATAGGCAACG-3’，SEQ ID NO：3，其中，5’端标记荧光基团FAM，3’端使标记淬灭基团BHQ-1。

4.按照权利要求1所述的一种数字PCR技术检测布鲁氏菌核酸DNA的方法，其特征在于，PCR反应体系包括：2╳ddPCR Supermix 10μL；待检核酸DNA 1μL；正向引物F1和反向引物R1各1.6μL，探针Probe 0.8μL，补水至20μL。

5.按照权利要求4所述的一种数字PCR技术检测布鲁氏菌核酸DNA的方法，其特征在于，引物和探针溶液的浓度皆为10μmol/L。

6.按照权利要求1所述的一种数字PCR技术检测布鲁氏菌核酸DNA的方法，其特征在于，PCR反应体系预处理过程如下：

(1)制备微滴：将20μL PCR反应体系和70μL的微滴生成油加入到微滴生成卡槽内，盖上胶垫，放入微滴生成仪中产生微滴；

(2)封膜：将微滴生成仪中产生微滴约40μL，用移液枪转移到96孔PCR板中，盖上锡纸膜，用封膜仪将96孔PCR板封膜；

(3)将封膜的PCR板，放在PCR仪中运行。

7.按照权利要求6所述的一种数字PCR技术检测布鲁氏菌核酸DNA的方法，其特征在于，数字PCR扩增条件为：95℃预变性10min；95℃变性30s，退火温度59℃，1min，循环40次；98℃酶失活10min。

8.按照权利要求6所述的一种数字PCR技术检测布鲁氏菌核酸DNA的方法，其特征在于，PCR扩增结果使用微滴分析仪，进行分析判断，将96孔PCR板放在微滴分析仪中读取荧光信号，通过软件对结果进行分析，阳性对照和阴性对照成立的前提下，计数阳性微滴数，即核酸DNA的拷贝数。