[发明专利]一种数字PCR检测布鲁氏菌核酸DNA的方法

说明书

一种数字PCR检测布鲁氏菌核酸DNA的方法，涉及分子生物学技术领域。本发明数字PCR技术，既可检测和鉴定纯菌布鲁氏菌核酸DNA，也可以检测和鉴定组织液如血液等微量布鲁氏菌核酸DNA；不仅可以定性的鉴定待测标本布鲁氏菌核酸DNA，也可以定量的检测待检样品的布鲁氏菌核酸DNA拷贝数，可检测核酸DNA最低量3.67fg/μL，即可检测的范围最小可到1个布鲁氏菌核酸DNA拷贝。另外，数字PCR结果分析能够标准化，可进行不同实验者数据比较。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，本发明涉及检测布鲁氏菌核酸DNA的数字PCR方法，运用本方法可以快速的、定量的检测出待测样品中布鲁氏菌核酸DNA的拷贝数。

背景技术

布鲁氏菌病(Brucellosis)简称布病，又称地热中海弛张热、马耳他热或波浪热，俗称“懒汉病”，是由细胞内寄生的布鲁氏菌属(Brucella)细菌引起的一种人兽共患传染—变态反应性疾病，布病广泛分布于世界各地。

目前已知有60多种家畜、家禽、野生动物是布鲁氏菌的宿主。与人类有关的传染源主要是羊、牛及猪，其次是犬。病畜的血液等组织中，以及其分泌物、排泄物、流产物及乳类含有大量病菌，在动物间传播，造成带菌或发病。人通过接触布病感染的动物、食用布鲁氏菌污染的奶制品以及实验室接触等传播方式引起布鲁氏菌感染。

传统的布鲁氏菌病的检测方法主要有培养方法和血清学方法，但布鲁氏菌分离培养的敏感性低、耗时、费力，而且具有较大的生物安全性危害。血清学方法存在着假阳性和假阴性的结果，影响了检测结果。

随着分子生物学技术的发展，PCR方法(包括普通PCR和荧光定量PCR)已被用于布鲁氏菌病的辅助诊断和病原体的检测鉴别中。对待检样品中的微量核酸DNA，单一引物的普通PCR和多重PCR方法难以检测；荧光定量PCR技术是一种集PCR技术、荧光信号检测和数据分析于一体的核酸定量检测技术。对纯菌DNA具有很高的特异性、灵敏性，准确性及假阳性率低等特点，可以检测到1个拷贝数的核酸DNA，但是目前荧光定量PCR技术，由于组织液血液中的影响因素众多，导致假阳性率和假阴性率均较高，影响其在组织血液中布鲁氏菌核酸DNA检测中的应用。

数字PCR(Droplet Digital PCR，dd PCR))是几年来兴起的第三代PCR技术，其原理是将预混的的PCR反应体系进行微滴化处理，形成几万个油包水的液化微滴中，理想的状态是每个微液中含有一个或者不含有核酸DNA，经过PCR扩增后，使用荧光检测器检测每个微滴中的阳性微滴数和阴性微滴数，根据泊松分布原理计算出核酸DNA的拷贝数，与实时荧光定量PCR相比，该方法具有精确、灵敏度高和不易受PCR抑制物影响等优点，因此本发明在于研发针对布鲁氏菌核酸DNA检测的数字PCR技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一种特异的定量检测布鲁氏菌核酸DNA的数字PCR方法，配置PCR反应体系，经过预处理后，在一定的PCR反应条件下，使用PCR仪，进行PCR扩增，扩增结果使用微滴分析仪，进行分析判读。所述PCR反应体系，包括：待检样品核酸 DNA、2╳ddPCRSupermix、引物、探针和双蒸馏水。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种数字PCR检测布鲁氏菌核酸DNA的方法，可以定量的检测布鲁氏菌核酸DNA，包括以下步骤：

(1)待检测样品核酸DNA的提取，可提取布鲁氏菌核酸DNA的方法皆可；待检核酸DNA 为提取的核酸DNA；

(2)引物对的设计：在布鲁氏菌特异的编码bcsp31蛋白的基因核苷酸序列上设计引物和探针，其核苷酸序列如下：

正向引物：F1：5’-ACCTTGCCCTTGCCATCAT-3’，SEQ ID NO：1；

反向引物：R1：5’-AGTCCGGCTTTACGCAGTCA-3’，SEQ ID NO：2；