[发明专利]一种食品中降红木素的定性定量检测方法

权利要求书

1.一种食品中降红木素的定性定量检测方法，包括如下步骤：

a、色素提取：取样品先用醋酸乙腈溶液均质提取，然后用无水硫酸钠和氯化钠水平振荡提取，离心，得上清液；

b、净化：向上清液中加入C18和Florisil吸附剂振荡混合，冷冻离心，静置，旋转蒸发、氮吹干，定容后滤膜过滤，得净化后样液；

c、标准溶液配制：将不含降红木素的同种类基质空白样品按上述步骤a和b处理后，得样品提取净化液，加入标准溶液，涡旋混匀，配制成不同浓度的降红木素标准工作液；

d、定性检测：将步骤b中净化后样液注入UPLC-Q-TOF/MS仪器中，在TOF/MS模式下进行一级全扫描，获得TOF/MS全扫描数据，与数据库比对，在质量精确度绝对值小于10ppm，保留时间偏差在0.25min之内，且得分≥70时，初步确定样液中疑似有降红木素；在Q-TOF/MS方法条件下，将步骤b中净化后样液进行再次测定，获得样品碎片离子全扫描信息，经过与Q-TOF/MS数据谱库中的碎片离子信息检索比对，得到二级检索得分，二级检索得分≥70的化合物被确证为降红木素；二级检索得分＜70的化合物通过背景扣除来降低杂质离子对检索的影响，并对比其主要碎片离子，若有两个或两个以上的主要碎片离子匹配，则样液中含有降红木素，反之，样液中则不含有降红木素。

2.根据权利要求1所述的食品中降红木素的定性定量检测方法，其特征在于，Q-TOF/MS数据谱库为使用精确质量、可选保留时间和MS/MS质谱图来进行检索的谱库，含有图形文件；数据库为使用精确质量和可选保留时间，来进行检索的化合物数据库，不含有图形文件。

3.根据权利要求1所述的食品中降红木素的定性定量检测方法，其特征在于，降红木素的Q-TOF/MS数据谱库信息如下所示：

4.根据权利要求1所述的食品中降红木素的定性定量检测方法，其特征在于，降红木素的Q-TOF/MS数据谱库是按如下方法建立的：在步骤d中相同的液相色谱和质谱条件下，配制浓度为1μg/mL的降红木素标准溶液，在LC-Q-TOF/MS全扫描模式下进行测定，记录降红木素的精确分子量和保留时间；在Targeted MS/MS采集界面输入降红木素的母离子，保留时间和相应的碰撞能量，进行数据采集，选择碎片离子信息较为丰富的4个碰撞能量下的质谱图，并导出CEF文件，将CEF文件导入PCDL软件中，与降红木素信息相关联并保存，即得数据谱库。

5.根据权利要求1所述的食品中降红木素的定性定量检测方法，其特征在于，降红木素的定量检测：将步骤c中的各浓度梯度的标准工作液进行UPLC-Q-TOF/MS测定，以标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到基质标准工作曲线；在相同条件下将步骤b中净化后的样品液注入UPLC-Q-TOF/MS进行测定，测得样品液中降红木素的色谱峰面积，代入基质标准工作曲线，得到样品液中降红木素含量，然后根据样品液所代表试样的质量计算得到样品中降红木素含量。

6.根据权利要求1所述的食品中降红木素的定性定量检测方法，其特征在于，降红木素标准工作液浓度分别为0.5μg/mL、1μg/mL、4μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL。

7.根据权利要求1所述的食品中降红木素的定性定量检测方法，其特征在于，步骤a中醋酸乙腈溶液的质量浓度为5％，每克样品中醋酸乙腈的加入量为5mL；均质提取时间为：1min；每克样品中无水硫酸钠(Na2SO4)和氯化钠(NaCl)加入量分别为1.0g和0.5g，振荡提取时间为30min，离心转速为9000r/min，离心时间为5min。

8.根据权利要求1所述的食品中降红木素的定性定量检测方法，其特征在于，步骤b中，每体积提取液中C18和Florisil加入量分别为20mg和15mg，振荡混合时间为5min，冷冻离心为：在-2℃下以9000r/min离心5min，静置10min后，40℃旋转蒸发至近干，氮吹吹干，用体积比为1:1的0.1％甲酸水：乙腈溶液溶解定容，漩涡混匀后，经0.22μm滤膜过滤。

9.根据权利要求1所述的食品中降红木素的定性定量检测方法，其特征在于，步骤d中，液相色谱条件为：ZORBAX SB-C18色谱柱(100mm×2.1mm，3.5μm)；流动相A为乙腈，B为0.1％甲酸水溶液(含0.5mmol/L的乙酸铵)，梯度洗脱程序：0～0.5min，95％A；0.5～5min，95％～60％A；5～9min，60％～5％A；9～14min，5％A；14～14.1min,5％～95％A；14.1～18min；95％A；流速0.3mL/min；柱温35℃；进样量10μL；质谱条件为：电喷雾离子源，正离子模式；雾化气压力40psig；干燥气温度325℃；干燥气流速12L/min；鞘气温度325℃；鞘气流速12L/min；毛细管电压4000V；喷嘴电压1000V；传输电压110V；除液电压65V；扫描范围为50–1700m/z，扫描速率为3spectra/s。