[发明专利]一种快速检测基孔肯雅病毒的试剂盒在审
| 申请号： | 201910960373.6 | 申请日： | 2019-10-10 |
| 公开（公告）号： | CN110607401A | 公开（公告）日： | 2019-12-24 |
| 发明（设计）人： | 王静;慈颖;张晓龙;刘威;张乔;施琦;孙筱霞 | 申请（专利权）人： | 中国检验检疫科学研究院 |
| 主分类号： | C12Q1/70 | 分类号： | C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11;C12R1/93 |
| 代理公司： | 11465 北京慕达星云知识产权代理事务所(特殊普通合伙) | 代理人： | 崔自京 |
| 地址： | 100000 北京市大*** | 国省代码： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 基孔肯雅病毒 快速检测 试剂盒 引物 大型仪器 高敏感性 核酸检测 应用需求 指示剂 筛查 | ||
1.一种快速检测基孔肯雅病毒的特异性引物对，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列如下：
FP：5’-ACGGAGACGGGATGACGGTTTTGGAGCCAACACTATCG CT-3’；SEQ ID NO.1；
BP：5’-ACGGAGACGGGATGACGGTTACGCCGGTGAAGACCTTA-3’；SEQ ID NO.2；
IF：5’-TGTACTCGCACGTGATGTAATCA-3’；SEQ ID NO.3；
IB：5’-AGAGTGCAAGGACAAAAACCTAC-3’；SEQ ID NO.4。
2.含有权利要求1所述的特异性引物对的试剂盒。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，包括pH为8.8的反应液、dNTPs、Bst DNA聚合酶、AMV逆转录酶、FP及BP引物、IF及IB引物、指示剂和封闭剂。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，
最终反应体系中dNTPs各1.4mM、Bst DNA聚合酶8U、AMV逆转录酶8U、FP及BP引物各80pmol、IF及IB引物各40pmol；
反应液含(NH4)2SO4、KCl、MgSO4、Tween 20和甜菜碱；
各成分在最终反应体系中的工作浓度如下：(NH4)2SO410 mM、KCl 50mM、MgSO48mM、Tween200.1％和甜菜碱0.8M。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述指示剂包括显色指示剂和/或荧光指示剂；所述显色指示剂为甲酚红-苯酚红指示剂；所述显色指示剂包括甲酚红0.08mM和苯酚红0.02mM；所述荧光指示剂为1×水溶液的SYBR Green I或EveGreen荧光染料。
6.利用权利要求3所述的试剂盒检测基孔肯雅病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)利用Chelex裂解液对待检测样品进行混合，加热裂解；
(2)将步骤(1)裂解后的样品液作为RNA模板，加入反应体系中；并设置阳性和阴性对照；
(3)在61-68℃的条件下，恒温扩增30--50min，显色法观察判断结果或利用荧光法进行检测。
7.根据权利要求6所述的检测基孔肯雅病毒的方法，其特征在于，所述反应体系为50μL体系，包括：pH为8.8的所述反应液29μL、混合液1μL和RNA模板20μl；所述混合液包括dNTPs、Bst DNA聚合酶、AMV逆转录酶、FP及BP引物、IF及IB引物和指示剂。
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