[发明专利]一种巨型艾美耳球虫纳米亚单位疫苗及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种巨型艾美耳球虫纳米亚单位疫苗，其特征在于,所述的巨型艾美耳球虫纳米亚单位疫苗是由PLGA包裹重组蛋白EmMIC3形成的纳米粒子，所述的重组蛋白EmMIC3为巨型艾美耳球虫微线蛋白3，所述的重组蛋白EmMIC3的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述的纳米亚单位疫苗粒径为80nm-330nm；所述巨型艾美耳球虫纳米亚单位疫苗的制备方法包括以下步骤：

（1）将E. maxima pET-32a(+)-MIC3重组表达质粒转化到E. coli BL21感受态细胞，得到含有pET-32a(+)-MIC3重组表达质粒的细菌；

（2）表达纯化巨型艾美耳球虫重组蛋白EmMIC3；

（3）制备纳米亚单位疫苗PLGA-EmMIC3：用二氯甲烷溶解PLGA来制备PLGA的二氯甲烷溶液，其中PLGA的质量体积浓度为4-5g/100mL；向PLGA的二氯甲烷溶液中加入5%PVA，边涡旋边逐滴加入步骤（2）制备的重组蛋白EmMIC3，再涡旋混匀1~2min；冰浴条件下，超声破碎3-5min，形成乳白色的初乳液；往初乳液中边涡旋边加入5% PVA，冰浴条件下超声破碎3 -5min，形成复乳液；将超声后获得的复乳液边搅拌边挥发，直至有机溶剂挥发尽；再使用冷冻超速离心机28000-30000r/min离心30-40min；离心结束后，分别收集上清和沉淀；用去离子水重悬超速离心后获得的沉淀进而得到PLGA包裹的重组蛋白混悬液，将所述重组蛋白混悬液置于西林瓶中，-80℃放置1.5-2h，再将其转移到真空冷冻干燥机中，冷冻干燥20-24h得所述巨型艾美耳球虫纳米亚单位疫苗；其中，每次加入5%PVA的体积为PLGA的二氯甲烷溶液的体积的2~2.5倍；步骤（3）中每次超声破碎功率40-50W，超声3-5s，间隔5s。

2.根据权利要求1所述的巨型艾美耳球虫纳米亚单位疫苗，其特征在于，所述重组蛋白EmMIC3是将E. maxima重组表达质粒pET-32a(+)-MIC3在转入的大肠杆菌中进行表达，将表达出来的重组蛋白EmMIC3经His蛋白纯化柱纯化所得。

3.权利要求1所述的巨型艾美耳球虫纳米亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：

1）将E. maxima pET-32a(+)-MIC3重组表达质粒转化E. coli BL21感受态细胞，得到含有pET-32a(+)-MIC3重组表达质粒的细菌；

2）表达纯化巨型艾美耳球虫重组蛋白EmMIC3；

3）制备纳米亚单位疫苗PLGA-EmMIC3：用二氯甲烷溶解PLGA来制备PLGA的二氯甲烷溶液，其中PLGA的质量体积浓度为4-5g/100mL；向PLGA的二氯甲烷溶液中加入5%PVA，边涡旋边逐滴加入步骤（2）制备的重组蛋白EmMIC3，再涡旋混匀1-2min；冰浴条件下，超声破碎3-5min，形成乳白色的初乳液；往初乳液中边涡旋边加入5% PVA，冰浴条件下超声破碎3 -5min，形成复乳液；将超声后获得的复乳液边搅拌边挥发，直至有机溶剂挥发尽；再使用冷冻超速离心机28000-30000r/min离心30-40 min；离心结束后，分别收集上清和沉淀；用去离子水重悬超速离心后获得的沉淀进而得到PLGA包裹的重组蛋白混悬液，将所述重组蛋白混悬液置于西林瓶中，-80℃放置1.5-2h，再将其转移到真空冷冻干燥机中，冷冻干燥20-24h得所述巨型艾美耳球虫纳米亚单位疫苗；其中，每次加入5%PVA的体积为PLGA的二氯甲烷溶液体积的2-2.5倍；每次超声破碎功率40-50W，超声3-5s，间隔5s。

4.权利要求1所述的巨型艾美耳球虫-纳米亚单位疫苗在制备预防鸡巨型艾美耳球虫感染的药物中的应用。