[发明专利]用于检测鸡传染性贫血病毒的引物对、试剂盒和方法

权利要求书

1.一种用于检测鸡传染性贫血病毒的引物对，其特征在于，包括SEQ ID NO.1所示的CIAV-F70和SEQ ID NO.2所示的CIAV-R70。

2.一种用于检测鸡传染性贫血病毒的试剂盒，其特征在于，包括：权利要求1所述的引物对、阳性标准质粒、SYBR Green Premix Pro Taq实时荧光定量PCR试剂和ddH₂O；所述阳性标准质粒是由SEQ ID NO.3所示的DNA片段与pMD18-T载体相连接后得到的重组质粒。

3.一种用于检测鸡传染性贫血病毒的方法，其特征在于，具体过程为：以待测样品为模板，用权利要求1所述的引物对进行实时荧光定量PCR扩增，得到待测样品的循环阈值，再代入标准曲线得到待测样品的鸡传染性贫血病毒的含量；所述标准曲线为Y＝-3.334lgX+39.08，其中Y为循环阈值，X为质粒的拷贝数。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，实时荧光定量PCR扩增的反应体系为：SYBRGreen Premix Pro Taq 10μL、ddH₂O 7μL、CIAV-F70 0.5μL、CIAV-R70 0.5μL和模板2μL，实时荧光定量PCR扩增的反应程序为：95℃，3min；95℃，5s，55℃，15s，40cycles；95℃，30s，65℃，30s，95℃，30s。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述标准曲线由梯度浓度的阳性质粒荧光定量PCR扩增制得，所述阳性质粒由以下过程制得：以鸡传染性贫血病毒基因组为模板，使用权利要求1所述的引物对进行普通PCR扩增，克隆，测序比对确认质粒正确后，用质粒提取试剂盒进行质粒提取，再根据质粒浓度计算得到基因拷贝数，再以10倍倍比稀释至10⁰copies/uL，-20℃保存备用。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述普通PCR扩增的反应体系为：rTaq12.5μL、ddH₂O 9.5μL、CIAV-F70 0.5μL、CIAV-R70 0.5μL和模板2μL。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述克隆包括PCR产物纯化回收、目的片段连接和重组质粒的转化步骤。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述PCR产物纯化回收这一步骤的具体过程为：将PCR产物加入含Goldview的1％琼脂糖凝胶中，电泳30min，在紫外灯的照射下，切下目的条带，使用回收试剂盒进行回收，得到PCR纯化产物。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述目的片段连接这一步骤的具体过程为：将0.25μL PCR纯化产物、0.25μL pMD18-T Vector和2.5μL 2×Ligase Buffer混匀，然后置于PCR仪中16℃作用4h，-20℃保存，得到连接产物。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述重组质粒的转化这一步骤的具体过程为：将所述连接产物加入至感受态细胞，混匀后冰浴30min，然后42℃热激90s，然后冰浴10min；加入400μL LB液体培养基，在37℃恒温条件下培养45min，得到菌液；然后取100μL菌液涂布于含Amp的1.5％LB琼脂平板中，37℃恒温条件下倒置培养12～16h；所述Amp的浓度为100μg/mL。