[发明专利]一种IAPV感染性克隆的构建方法与应用有效
| 申请号： | 201910966313.5 | 申请日： | 2019-10-12 |
| 公开（公告）号： | CN110777156B | 公开（公告）日： | 2021-09-21 |
| 发明（设计）人： | 侯春生;邓帅;杨卅;代平礼;吴艳艳;王强;刁青云 | 申请（专利权）人： | 中国农业科学院蜜蜂研究所 |
| 主分类号： | C12N15/40 | 分类号： | C12N15/40;C12N15/86;C12N15/66;C12N1/21;A61K49/00;C12R1/19 |
| 代理公司： | 北京惟诚致远知识产权代理事务所(普通合伙) 11536 | 代理人： | 王慧凤 |
| 地址： | 100093*** | 国省代码： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 iapv 感染性 克隆 构建 方法 应用 | ||
1.一种IAPV感染性克隆的构建方法，包括下述步骤：
1）IAPV-BJ2病毒株基因组序列分段合成
合成IAPV全长基因组的cDNA：选择IAPV-BJ2病毒株序列，其序列如GenBank:MG599488.1所示；分成三个片段进行基因合成，这三个片段分别命名为片段1、片段2和片段3，其中片段1为T7启动子序列与其3’端连接的自GenBank: MG599488.1的5’端第1-3823位核苷酸拼接的核苷酸片段，片段2为自GenBank: MG599488.1的5’端第3804-6873位核苷酸片段，片段3为自GenBank: MG599488.1的5’端第6855-9599位核苷酸与其3’端连接的A序列拼接的核苷酸片段；T7启动子序列如SEQ ID NO.2所示，A序列如SEQ ID NO.3所示，三个片段分别用高保真酶通过PCR的方式并进行琼脂糖胶回收得到，经过DNA测序鉴定为正确序列；
2）含有病毒基因组的IAPV cDNA感染性克隆的构建
（1）IAPV基因组片段片段1和片段2的拼接：用引物pACYC1905F和引物IA6820-P1580R通过反向PCR线性化载体pACYC177，引物pACYC1905F的序列为SEQ ID NO.4，引物IA6820-P1580R的序列为SEQ ID NO.5，通过同源重组将步骤1）所述的片段1和片段2连接到线性化的pACYC177载体上，并将连接产物转化大肠杆菌感受态JM109，挑取菌落并进行PCR鉴定；将PCR鉴定为阳性的菌落进行培养并抽提质粒进行测序，将测序正确的质粒命名为pACYC-6.8k；
（2）IAPV基因组全长pACYC-IAPV的拼接：用引物IAPV6840R和引物pACYC1580R通过反向PCR线性化步骤（1）获得的载体pACYC-6.8k，引物IAPV6840R的序列为SEQ ID NO.6，引物pACYC1580R的序列为SEQ ID NO.7，通过同源重组将步骤1）所述的片段3连接到线性化的步骤（1）获得的载体pACYC-6.8k上，并将连接产物转化大肠杆菌感受态JM109，挑取菌落并进行PCR鉴定；将PCR鉴定为阳性的菌落进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的质粒即为拼接完成的含有IAPV全长基因组的cDNA质粒，命名为pACYC-IAPV，其序列如序列表中SEQID NO.1的所示。
2.权利要求1所述的IAPV感染性克隆的构建方法在制备获得活体蜜蜂感染模型的制剂中的应用。
3.权利要求1所述IAPV感染性克隆的构建方法在抗蜜蜂以色列急性麻痹病毒药物筛选的应用。
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