[发明专利]一种IAPV感染性克隆的构建方法与应用

说明书

本发明公开了一种IAPV感染性克隆的构建方法和应用。一种IAPV感染性克隆，其制备步骤是：(1)IAPV病毒BJ2株基因序列的分段合成；(2)IAPV病毒感染性克隆的组装与构建。本发明通过荧光定量试验、免疫印迹试验、毒理实验，药物抑制，活体蜜蜂喂毒等实验证明：本发明所构建的IAPV病毒感染性克隆可以拯救出具有与IAPV野生型病毒感染蜜蜂相同症状的病毒，并且在动物模型、病毒复制与致病机理、药物筛选等方面具有广泛的应用价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种IAPV感染性克隆，还涉及一种IAPV感染性克隆的制备方法，以及该克隆拯救出的报告病毒在抗病毒药物筛选中的应用。

背景技术

蜜蜂以色列急性麻痹病毒(IAPV)于2007年才在以色列被分离鉴定。该病毒可感染各个发育时期的蜜蜂个体(卵、幼虫、蛹、成蜂)和蜂群各级型蜜蜂(工蜂、雄蜂和蜂王)。自在以色列发现此病毒后，在世界各地均发现广泛存在，近年来发现也流行于亚洲地区，尤其是我国蜂群冬季流行较为普遍，已成为危害我国冬季蜂群损失最为严重的病害之一，甚至有的地区其蜂群感染率高达96％。其典型发病症状为:患病蜜蜂体色变暗，绒毛脱落，伴随翅震颤，逐渐麻痹抽搐死亡。病症与ABPV相似，并且其生物学和系统发育学特性都与ABPV和KBV非常接近，同时与ABPV和KBV核酸序列还有65％和75％的同源性。目前为止，实际生产中主要采用蜂群健康管理及其它化学试剂疗法预防IAPV，尚无特效抗IAPV感染的有效药物。为了减少该病毒的感染与发生，药物研发及昆虫病毒学家开展了深入的研究，包括病毒复制机制和致病机理等，以期为研制针对以色列急性麻痹病毒的药物，研发新型抗病毒生物制剂提供理论依据。

IAPV病毒属于双顺反子病毒属，双顺反子病毒属病毒基因组为一条正义单链RNA，可以直接作为模板(mRNA)进行病毒蛋白的翻译。典型的双顺反子RNA病毒基因组具有2个不重叠的开放阅读框(open reading frames，缩写为ORFs)，且在基因组两侧各有一个UTRs。基因组5′端有一个小基因连接蛋白(genome-linked virus protein，缩写为VPg)，3′端连接一个Poly A尾，二者具有维持基因组稳定和防护RNA分子降解的功能。2个ORFs之间的非翻译区被称为间隔区(intergenic region，缩写为IGR)。基因组近5′端和近3′端的2个ORFs分别编码合成非结构蛋白(non-structural protein)和结构蛋白(capsid protein)前体，然后进入位于5′端UTRs区和IGR区内的内部核糖体进入位点(internal ribosome entrysites，缩写为IRES)进行RNA基因组的翻译。

反向遗传学主要是针对RNA病毒研究的一项有效工具，是一种体外拯救病毒的有效方法。正常情况下是在质粒中构建通过PCR技术得到的全基因组序列，采用体外转录的手段获得该病毒全基因组RNA全长，将此RNA转染到合适细胞或相应活体能够拯救出具有致病性的病毒，此病毒的质粒称为感染性克隆。通过感染性cDNA克隆，研究人员可以在基因水平对病毒基因组进行各种修饰，通过其病毒的表型来判断对病毒的毒力的影响，从而深入研究病毒的感染特点与致病机制。因此，感染性克隆的构建解决了RNA病毒的众多难题。目前，已有许多RNA病毒的全长感染性克隆被报道，包括很多昆虫的RNA病毒，但是还未见有报道关于蜜蜂以色列急性麻痹病毒的感染性克隆。

发明内容

本发明提供一种蜜蜂以色列急性麻痹病毒感染性克隆的构建方法，以及该感染性克隆在抗病毒药物筛选方面的应用。本发明所构建的蜜蜂以色列急性麻痹病毒感染性克隆将为深入开展蜜蜂病毒的复制、致病特点、包装机制等基础理论研究以及药物研发、功能评价等应用研究提供有效的技术平台，为保护蜜蜂健康提供有力的技术支撑。